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Découverte des benzotriazolo [4,3-d] [1,4] diazépines en tant qu’inhibiteurs oraux des bromodomaines BET

The bromodomain

et la famille des terminaux supplémentaires (BET) est composée de BRD2, BRD3, BRD4 et

BRDT, dont chacun contient des bromodomains en tandem (BD-1 et BD-2)

reconnaître des résidus de lysine acétylés spécifiques dans les queues N-terminales

d’histones.1 Membres de la famille BET

moduler l’expression des gènes en recrutant des régulateurs transcriptionnels

à des emplacements génomiques spécifiques.2 En 2009,

la Mitsubishi Tanabe Pharma Corporation a signalé la première petite

inhibiteurs moléculaires de cette famille d’adaptateurs de chromatine, 3 et publications sur l’utilisation des inhibiteurs BET

pour démontrer l’activité antitumorale4 et

moduler l’inflammation.

ablation génétique ou un traitement inhibiteur spécifique ont établi

le rôle des membres de la famille BET dans la régulation des gènes cruciaux pour la normalité

croissance cellulaire.6 − 8Des études ultérieures9,10 ont

défini un lien mécanistique entre la puissance de l’inhibition BET et l’activité

contre les malignités hématologiques et a démontré que l’inhibition BET

régule l’oncogène MYC, ce qui entraîne le cycle cellulaire

arrestation et apoptose. Inhibition de la bromodomaine BET in vivo

conduit à l’efficacité dans les modèles de xénogreffes représentant plusieurs cancers

types, et BET bromodomains sont également impliqués dans des indications non-cologiques,

c’est-à-dire le virus de l’immunodéficience humaine et le virus t-lymphotrophique humain

expression génique, réponse aux dommages de l’ADN et hypertrophie cardiaque. Surtout,

Il a été montré que les inhibiteurs BET régulaient sélectivement un sous-ensemble de

plusieurs cytokines inflammatoires, y compris les interleukines 6, 1 &#x003b2 ;,

17, 21 et 23, et facteur de croissance des colonies de granulocytes macrophages11,12 et ont démontré leur efficacité dans plusieurs modèles in vivo d’inflammation, y compris le choc endotoxique, expérimentale

l’encéphalomyélite auto-immune, et l’arthrite.5,11Schéma 1Vue d’ensemble de l’origine et du développement de différents dérivés de l’azépine

BET InhibitorsTable 1BRD4 BD-1

Structure – Relations d’activité de benzo [b] isoxazolo [4,5-d] azépinesA cause de

l’application thérapeutique potentielle de l’inhibition BET, nous avons initié

un programme de découverte de médicaments et a récemment rapporté sur une base de fragment

effort qui a abouti à une série d’isoxazolo [5,4-c] thiéno [2,3-e] azépine BET inhibiteurs illustrés

par CPI-3 (Schéma 1) .13 Parallèlement à cet effort, nous étions intéressés

en explorant une connectivité différente au sein de l’anneau à sept membres

cela fournirait une base unique pour la modulation de la physico-chimique

propriétés et la puissance BET des composés résultants. Plus précisément,

nous avons émis l’hypothèse que le changement de l’imine cyclique à une aniline substituée

conserverait la forme concave importante pour la liaison spécifique à la

bromodomaine tout en fournissant un profil métabolique différent pour

séries. Nous étions également intéressés par l’évaluation d’un éditeur de liens modifié

combinaison avec l’élément de liaison triazole signalé4,5 et en trouvant un remplacement pour le groupe thiophène de CPI-3 en raison de son instabilité métabolique potentielle. Ici nous décrivons

la benzo [b] isoxazolo [4,5-d] azépine résultante et la benzotriazolo [4,3-d] [1,4] diazépine

série, qui étaient des inhibiteurs puissants de BET bromodomaines dans biochimique

et les tests cellulaires et qui a permis l’optimisation du métabolisme

stabilité et démonstration d’un effet pharmacodynamique chez une souris

modèle de suppression de l’IL-6 (Schéma 1). Nos études ont commencé avec la préparation du fragment benzo [b] isoxazolo [4,5-d] azépine 1 (Schéma 1), qui présentait une liaison BRD4 BD-1.

affinité dans un test AlphaLISA (AS) comparable à celle de la 3-méthyl-4-phénylisoxazol-5-amine

fragment d’où est dérivé le CPI-3 (IC50 33 μ M) 13 et qui fournit plusieurs

vecteurs à utiliser pour améliorer la puissance. Parmi eux, la N-arylation

pour former le composé 4-cyano 4 (tableau 1) nettement amélioré la puissance biochimique et l’activité dans un

lecture cellulaire de la suppression de l’IL-6, phénotype apparenté à BET

à la modulation de la réponse immunitaire in vivo (voir Information de support pour plus de détails). Tout au long de

nos études, BRD4 BD-1 a été utilisé comme un substitut pour l’ensemble BET

famille; tests de composés individuels contre les bromodomaines de

BRD2, BRD3 et BRDT ont soutenu cette hypothèse (voir ci-dessous). Une variété de substitutions autour de l’anneau ont été explorées; 4-CN-Ph

était toujours la substitution la plus puissante et est la seule

montré ici, pour la simplicité. La puissance pourrait être encore améliorée avec

l’addition d’un hétérocycle en position 8, comme dans le composé 5 (tableau 1, voir numérotation). introduction

d’un groupe méthyle sur l’azépine (Tableau 1, 6) a maintenu une activité biochimique mais une traduction améliorée

de cette puissance dans un contexte cellulaire, peut-être en offrant plus

préorganisation conformationnelle du composé, qui a été montré

pour améliorer la perméabilité cellulaire.14,15 Une variété de substitués

hétérocycles ont été tolérés à la position 8, comme exemplifié par les composés 7 et 8, mais tous les groupes attachés à l’azépine

un cycle autre que méthyle était nuisible à l’activité (par exemple, le composé 9 dans le tableau 1, voir le tableau S7 pour d’autres exemples). La limitation au méthyle à

la position 4 est en contraste avec ce que nous avons observé avec l’échafaudage isoxazolo [5,4-c] thiéno [2,3-e] azépine (voir CPI-3) 13 et avec ce que d’autres ont

observé avec des échafaudages connexes.4,5 Substitutions à d’autres

positions du cycle benzo ou à la position 1 de l’isoxazole

puissance diminuée (données non montrées) .Tableau 2BRD4 BD-1

Structure – Relations d’activité des benzo [1,2,4] [4,3-d] triazolo [1,4] diazépines Au cours de l’optimisation de la puissance, nous avons déterminé

stabilité métabolique in vitro de plusieurs composés. Comme montré

dans le tableau 1, la clairance dans les microsomes hépatiques était

généralement élevé pour la série à travers les espèces, que nous avons supposé

ont été dues aux valeurs élevées de clogP intrinsèques à la classe.14 Remplacement de l’isoxazole par un triazole

l’élément contraignant a offert l’occasion de réduire la portée du

séries; Des estimations simples de la lipophilie16 suggèrent que l’hétérocycle le plus polaire

clogP d’une unité par rapport aux isoxazoles correspondantes tout en

la forme globale et le mode de liaison de la série initiale, permettant

nous pour capitaliser sur la structure similaire et les relations d’activité # x02013;

(SARs) .Pour explorer si le triazole pourrait être combiné avec

l’aniline azepine lieur, nous avons préparé le fragment de triazole 2 (Schéma 1) et l’avons trouvé, aussi,

BRD4 lié avec une puissance comparable à 1. Même avec le

changement dans l’hétérocycle, une grande partie du SAR de la série benzo [b] isoxazolo [4,5-d] azépine pourrait être récapitulée; La N-arylation améliore la puissance (Tableau 2, 10), tout comme l’incorporation de certains hétérocycles au 8

position (Tableau 2, 11). En revanche

avec la série benzo [b] isoxazolo [4,5-d] azépine,

Le 4-Cl-Ph était toujours le substituant N-aryle le plus puissant

pour les benzotriazolo [4,3-d] [1,4] diazépines, bien que,

encore une fois, une variété de modèles de substitution ont été tolérés. Comme avant,

méthylation ultérieure à la position 4 de l’anneau azépine (tableau 2, 12) fourni des composés très actifs

dans les dosages biochimiques et cellulaires. En outre, les substitutions d’azépine

autre que le méthyle a entraîné une perte de puissance d’environ 10 fois,

exemplifié par 14 (tableau 2;

exemples dans le tableau S7). Séparation du

énantiomères individuels de composés élaborés établi que la plupart

de l’activité de liaison résidait dans un énantiomère; le composé 3 (98% ee) était plus de 50 fois plus puissant que 15 (> 99% ee, tableau 2). Gratifiantly, la clairance intrinsèque des microsomes hépatiques in vitro dans cette série

était généralement inférieure à celle des isoxazoles correspondants (par ex.

LM Clint de 6 contre 12 entre les espèces),

même si l’incorporation du chlorophényle, qui était optimale pour

la puissance, renvoyé le clogP de la plupart des composés dans la même gamme

celui de la série des isoxazoles. Enfin, pour déterminer l’impact de

substitution alternative méthyle sur le cycle azépine, le composé 16 a été préparé. Il a démontré peu de changement dans la puissance

par rapport à 10 non substitué, même si à la fois 4 et

On s’attendrait à ce que les substituants 5-méthyle préorganisent l’azépine,

suggérant que la position du substituant méthyl-azépine était

important au-delà de son effet sur la conformation de l’azépine

Une structure de co-cristal de 3 obtenue en BRD4 BD-1 a établi le mode de liaison de ces

série (Figure ​ (Figure1a) .1a). Notamment, il complétait

le site de liaison similaire à nos isoxazolo [5,4-c] thiéno [2,3-e] azépines rapportés, comme illustré par une superposition

des structures cristallines de 3 (choisi pour la simplicité)

et IPC-3; RMSD entre les atomes lourds communs du

deux séries étaient seulement de 0,43 (Figure ​ (Figure1b) .1b). Comme prévu, 3 ont adopté une forme en coupe, remplissant l’espace entre Asn140

et l’étagère WPF (résidus 81 – 83) et en faisant des contacts lipophiles

autour du résidu de gatekeeper Ile146. La paire solitaire de l’azote triazole

dans la position 3 servi d’accepteur H-liaison dans l’interaction cruciale

avec Asn140 (hautement conservé parmi les bromodomaines), en positionnant

groupe méthyl triazole dans le même emplacement que le N-acétyle du substrat de lysine acétylée naturelle et l’orientation

l’azote en position 2 pour s’engager dans une liaison hydrogène traversant l’eau

avec Tyr97. Le substituant 4-méthyl-azépine a fourni un second, non-canonique

H-lien donnant l’interaction17,18 avec l’Asn et forcé

la courbure de l’azépine. La structure de co-cristal a permis

l’attribution sans équivoque de la stéréochimie à cette position

(de même que la structure co-cristalline de l’énantiomère opposé, 15, figure S2). Fait intéressant,

la proximité observée entre l’aminopyridine de 3 et Trp81 suggère que la puissance accrue des composés substitués

à cette position peut avoir été due à une interaction productive face à face.Figure 1 (A) A 1.4 Å structure de cocrystal de 3 (vert) lié

à BRD4 BD-1. Code PDB: 4Z1Q. Les interactions clés H-liaison sont indiquées.

(B) Une superposition d’une structure de co-cristal de 13 (vert)

avec un de CPI-3 (gris) montre la similitude dans la liaison

modes entre … Pour approfondir cette idée, nous avons examiné un certain nombre de

composés avec une plus grande variété de substituants à la position 8. Comme

représenté dans le tableau 3, substituants hétéroaromatiques

comme la pyridine (17), la pyrolidinone (18),

et triazole N-lié (19) a donné des composés avec puissant

activité de liaison et cellulaire. Un carboxamide primaire (20) a également amélioré la puissance cellulaire d’environ 3 fois par rapport à 13 non substitué (tableau 2). Fait intéressant, les composés

impossible d’aligner un π système avec le bord de Trp81, tels que 21 et 22, puissance perdue par rapport à 13, compatible avec le modèle d’une conduite d’interaction face à face

l’affinité de liaison à la position 8. Sur la base de son

combinaison favorable de l’activité cellulaire et des propriétés ADME, le composé 3 a été choisi pour la pharmacocinétique in vivo

profilage chez le rat. Comme le montre le tableau 4, 3 ont démontré une clairance iv inférieure de dix pour cent au sang du foie

écoulement, une demi-vie raisonnable et une biodisponibilité orale appréciable.

Fait important, ce profil suggère que l’exposition de 3 serait suffisante pour moduler l’IL-6 dans un modèle in vivo. Avant de procéder à des expériences pour évaluer le BET

activité de 3in vivo, nous avons déterminé

son affinité de liaison aux bromodomaines des autres membres de la BET

famille. Comme mentionné ci-dessus, BRD4 BD-1 s’est avéré représentatif de l’activité

contre d’autres protéines BET; IC50 variait de 0,003 à

0,017 μ M (voir Informations de support pour les valeurs individuelles). Parce que les bromodomaines sont hautement homologues

à travers la classe, 19 nous avons également évalué la

activité de 3 contre huit autres bromodomaines non-BET,

tel qu’estimé par AlphaLISA ou par résonance de fluorescence résolue en temps

transfert d’énergie. À l’exception de la protéine de liaison CREB (CBP)

(AS IC50 = 2,2 μ M), 3 ont démontré

IC50 supérieure à 15 μ M sur tous les bromodomains

testé (voir Informations complémentaires), suggérant

que son activité in vivo serait limitée à la

Famille BET aux concentrations pertinentes.Après avoir établi

son activité BET, sa spécificité et son potentiel pour une exposition in vivo significative, 3 ont reçu une dose de PO

15 mg / kg à divers moments avant la stimulation par le LPS. Plasma IL-6

les niveaux ont été mesurés 2 h plus tard. Comme le montre la figure ​ Figure2,2, la libération d’IL-6 a été supprimée à des niveaux de référence à des niveaux plus élevés

concentrations plasmatiques de 3 et retourné vers le véhicule

niveaux au cours du temps de dosage, en conjonction avec décroissant

concentrations plasmatiques de 3. Suppression substantielle de

la réponse IL-6 dans cette expérience a été observée seulement lorsque les prévisions

concentration plasmatique libre du composé était supérieure à la EC50,20 cellulaire compatible avec la drogue libre

hypothèse21. Ces résultats appuient la

modèle d’inhibition BET induisant une réduction de la réponse inflammatoire

Niveaux d’IL-6 et recommandent en outre BET comme une cible pour la découverte de médicaments.Figure 2Suppression de la libération d’IL-6

chez la souris corrèle avec l’exposition plasmatique de 3

15 mg / kg de dosage PO. Concentration libre de 3 calculée

basé sur 98% PPBmouse. La ligne pointillée indique IL-6 cellulaire

EC50.Tableau 3BRD4 BD-1 Structure – Relation d’activité de

Benzotriazolo [4,3-d] [1,4] diazépines substituées en 8 En résumé, nous rapportons la découverte

de benzo [b] isoxazolo [4,5-d] azépines et de benzotriazolo [4,3-d] [1,4] diazépines en tant que deux nouvelles séries d’inhibiteurs BET

combiner des éléments de conception de nos isoxazolo [5,4-c] thiéno [2,3-e] azépines avec une azépine unique

modèle de connexion. Les deux séries ont fourni biochimiquement et cellulaire

composés puissants, dont certains pourraient être optimisés pour la stabilité métabolique

et appliqué in vivo pour démontrer dose-dépendante

modulation de la suppression de l’IL-6 via un engagement BET. D’autres applications

de ces séries seront rapportés en temps voulu. Tableau 4 Paramètres pharmacocinétiques et paramètres in vitro sélectionnés

pour 3 dans RatAcknowledgementsWe sont reconnaissants

à Ted Peters et Christina Lee dans le groupe Lead Discovery pour le placage

les composés utilisés dans ces études; PPD BioDuro pour synthétiser certains

des composés présentés ici; et WuXi AppTec et les services de RMN personnalisés

pour la caractérisation des composés.