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Utilisation de l’immunohistochimie pour évaluer l’exactitude du diagnostic histomorphologique de l’aspergillose et de la mucormycose

Nous avons donc étudié l’exactitude du diagnostic histomorphologique de la mucormycose et de l’aspergillose, en utilisant l’immunohistochimie. Tests d’immunohistochimie pour la mucormycose et l’aspergillose Les patients ont rencontré les critères modifiés pour une mucormycose prouvée et probable pendant une – Nous avons d’abord testé la performance diagnostique de l’IHC pour la mucormycose et l’aspergillose dans des cas avérés. Ensuite, nous avons déterminé la précision du diagnostic histomorphologique des cas probables, en utilisant le Tests de l’IHCRésultats Dans les cas avérés de mucormycose, la sensibilité et la spécificité de la mucormycose étaient respectivement de%% intervalle de confiance,% -% et%% -% dans les cas avérés d’aspergillose et la sensibilité et la spécificité de l’aspergillose. % et%% -%, r Des cas probables de mucormycose,% étaient positifs avec mucoviscidose IHC,% étaient positifs avec aspergillose IHC positifs positifs pour les deux, et étaient négatifs avec les deux cas d’aspergillose probable,% étaient positifs avec l’aspergillose IHC,% étaient positifs avec IHC mucormycose, et% Conclusion: L’aspergillose et la mucormycose ne semblent pas correctement diagnostiquées morphologiquement, car certains des cas probables présentaient soit un test avec les deux anticorps, soit un défaut de coloration avec l’anticorps homologue. En l’absence de résultats de culture fongique, les tests IHC semblent utiles. différencier entre l’aspergillose et la mucormycose

mucormycose, aspergillose, histomorphologie, immunohistochimieL’incidence des infections fongiques systémiques est parallèle à l’utilisation accrue du traitement immunosuppresseur, des stéroïdes et des médicaments cytotoxiques La prévalence de la mucormycose, en particulier, augmente avec l’utilisation croissante d’agents antifongiques avec des anti-Aspergillus En outre, parce que le voriconazole n’a aucune activité dans la mucormycose, mais entraîne une meilleure survie des patients atteints d’aspergillose pulmonaire invasive IPA que l’amphotéricine B [, ], en distinguant IPA et mucormycose pulmonaire Les PM sont cliniquement importants Bien que des diagnostics définitifs puissent être faits en associant diagnostic histomorphologique et résultats de culture fongique, les cultures sont souvent négatives, notamment pour la mucormycose Dans cette situation, le diagnostic histomorphologique Cependant, defi Le diagnostic nitif n’est pas toujours possible sur la base de la morphologie des éléments fongiques dans les tissus en raison des similitudes morphologiques entre les formes tissulaires de plusieurs genres fongiques et la présence fréquente d’éléments fongiques clairsemés ou atypiques Nous avons donc évalué la mucormycose et l’aspergillose immunohistochimie tests IHC et ensuite utilisé ces tests pour déterminer l’exactitude des diagnostics histomorphologiques de l’aspergillose et mucormycose

Méthodes

Population étudiée et conception

Cette étude a été réalisée au Centre Médical Asan, un hôpital universitaire de soins tertiaires à Séoul, en Corée du Sud. Les dossiers médicaux des patients adultes ≥ ans répondant aux critères de mucormycose avérée et probables de janvier à décembre ont été revus rétrospectivement. On a donc estimé que le nombre de cas d’aspergillose invasive au cours des dernières années serait similaire au nombre de cas de mucormycose au cours de la période d’étude tous les patients qui répondaient aux critères d’aspergillose prouvée et probable IPA de Janvier à Décembre ont également été revus rétrospectivement Parce que le galactomannane GM dosage immunologique enzymatique Platelia Aspergillus [Bio-Rad]; Les résultats GM étaient disponibles pour les cas d’aspergillose invasive et de mucormycose enrôlés entre et Parmi les patients qui répondaient aux critères ci-dessus, ceux inclus dans l’étude comprenaient ceux avec du formol, Dans la première partie de l’étude, nous avons testé les performances diagnostiques des tests de mucormycose et d’aspergillose dans des cas de mucormycose et d’aspergillose avérées. Pour tester la réactivité croisée de ces anticorps contre d’autres infections fongiques, à savoir: candidose, fusariose, et scedosporose et infection non fongique c.-à-d. tuberculose, nous avons réalisé des IHC sur des échantillons de tissus de candidose, fusariose et scedosporiose prouvées en culture entre et et culture de tuberculose prouvée entre et Nous avons également vérifié la réactivité de la coloration IHC sur des cultures pures de Candida albicans, fixées au formol et incluses en paraffine, Aspergillus fumigatus, Aspergillus nidulans, Rhizopus stolonifer, Cunninghamella bertholletiae, Pénicillium chrysogenum, Fusarium solani et Scedosporium apiospermumDans la deuxième partie de l’étude, nous avons déterminé l’exactitude du diagnostic histomorphologique des PM et IPA probables en utilisant les tests IHC Nous avons également examiné le niveau d’accord Deux pathologistes indépendants et expérimentés, YSP et JSS, avec des années d’expérience en pathologie pulmonaire, ont respectivement examiné tous les patients atteints d’aspergillose et de mucormycose sans connaître les résultats de l’aspergillose et de la mucormycose IHC et de la culture fongique. le comité d’examen institutionnel de notre hôpital

Définitions

Nous avons utilisé les critères modifiés du groupe d’étude EORTC / MSG de l’Organisation Européenne de Recherche et de Traitement du Cancer / Mycose car l’invasion tissulaire par les hyphes fongiques est considérée comme une preuve définitive de la maladie fongique invasive. comme démontré par la preuve mycologique dans les cas stériles positifs à la culture et probables dans les cas non stériles de culture ou s’il n’y avait aucune évidence mycologique excepté le dosage de GM En bref, la mucormycose prouvée a été définie comme évidence histologique d’invasion tissulaire incluant Rhizopus spp, Cunninghamella spp, Apophysomyces spp, Saksenaea spp, Absidia spp, Mucor spp par culture à partir d’échantillons stériles Probable PM a été définie comme la preuve histologique ci-dessus avec ou sans récupération des agents de mucormycose par culture à partir de spécimens non stériles, tels que les expectorations ou la lave broncho-alvéolaire Le IPA a été défini comme preuve histologique de l’invasion tissulaire incluant des champignons filamenteux cloisonnés et à forte ramification plus la récupération d’espèces d’Aspergillus par culture à partir d’échantillons stériles L’IPA probable a été définie comme preuve histologique ci-dessus plus récupération d’espèces d’Aspergillus par culture d’échantillons non stériles, tels que les expectorations et / ou le liquide BAL, ou les dosages GM positifs

IHC

L’IHC a été réalisée sur des coupes de tissus fixés au formol et inclus en paraffine en utilisant un manuel pour la mucormycose ou un dispositif IHC automatique pour l’aspergillose, Benchmark XT; Ventana Medical Systems Nous avons utilisé le protocole manuel pour l’IHC mucormycose car il donnait une meilleure qualité de coloration que le protocole automatique. Brièvement, des coupes de tissus entiers de -μm-épaisseur ont été transférées sur des lames adhésives enduites de poly-L-lysine et séchées à ° C pendant quelques minutes. ont été récupérés en appliquant de la vapeur à ° C soit en minutes en mmol / L de tampon citrate pH pour coloration manuelle ou pour heure en acide éthylène diamine tétraacétique pH en autostainer Les échantillons ont été incubés avec l’anticorps monoclonal de souris anti-Rhizopus arrhizus:; clone WSSA-RA-; LSBio par heure à température ambiante ou anticorps monoclonal de souris anti-Aspergillus:; clone WF-AF-; LSBio dans les sections d’autostainer ont ensuite été incubées avec le Dako Envision System Kit K; Dako pendant quelques minutes, puis développé avec la solution DAB de ‘- diaminobenzidine Dako pour une coloration manuelle ou avec un kit optiView Universal DAB Ventana Medical Systems dans les diapositives de l’autostainer ont été contre-colorées avec de l’hématoxyline de Harris

Analyses statistiques

La performance diagnostique a été exprimée en termes de sensibilité et de spécificité La concordance entre les pathologistes a été évaluée à l’aide de la statistique. Tous les tests de signification ont été suivis, et les différences ont été considérées statistiquement significatives à P & lt; Les calculs ont été effectués en utilisant le logiciel logiciel SPSS pour Windows version K; SPSS

RÉSULTATS

Caractéristiques de l’étude

Au cours de la période d’étude, nous avons identifié des patients atteints de mucormycose pour lesquels des tissus fixés au formol et inclus en paraffine étaient disponibles; Nous avons également identifié des patients atteints d’aspergillose pour lesquels des tissus fixés au formol et inclus en paraffine étaient disponibles, y compris des patients présentant une aspergillose prouvée et un IPA probable. Les données cliniques détaillées et les diagnostics figurent dans les tableaux supplémentaires –

Performance diagnostique de l’IHC

Nous avons testé la performance diagnostique de la mucormycose et de l’aspergillose chez des patients présentant une mucormycose avérée et une aspergillose prouvée. La sensibilité et la spécificité étaient respectivement de%%, intervalle de confiance,% -% et%% -% pour la mucormycose et%% -% et%% -% pour l’aspergillose Tableau IHC Nous avons testé la réactivité croisée de la mucormycose et de l’aspergillose en cas de candidose avérée, de fusariose avérée, de scédosporiose avérée et de tuberculose Aucun de ces cas n’était positif mucormycose ou aspergillose IHC Nous avons également vérifié la réactivité de l’IHC dans des cultures pures de différents organismes fongiques fixés au formol et inclus en paraffine. Figure complémentaire Résultats de l’aspergillose et de la mucormycose IHC, respectivement, pour certaines cultures pures: et faible positif; Un nidulans, positif et négatif; R stolonifer, négatif et positif; C bertholletiae, équivoque et positive; et P chrysogenum, positifs et négatifs Dans des cultures pures de C albicans, F solani et S apiospermum, les résultats de l’aspergillose et de la mucormycose étaient négatifs

Tableau Résultats diagnostiques de la mucormycose et de l’aspergillose Tests immunohistochimiques dans la mucoviscidose prouvée et l’aspergillose prouvée Résultats du test IHC Mucormycose prouvée, nombre de cas n = Aspergillose prouvée, nombre de cas n = Performance diagnostique% IC Mucormycose Sensibilité positive: – Spécificité négative: – Aspergillose positive Sensibilité: – Spécificité négative: – Résultats du test IHC Mucormycose prouvée, Nombre de cas n = Aspergillose prouvée, Nombre de cas n = Performance diagnostique%% IC Mucormycose Sensibilité positive: – Spécificité négative: – Aspergillose Sensibilité positive: – Spécificité négative: – Abréviations : IC, intervalle de confiance; IHC, immunohistochimieView Large

Figure Vue largeTéléchargement de diapos photomicrographies représentatives de mucormycose et d’aspergillose A, coloration périodique acide-Schiff montre typique hyphes ramifiés à angle droit sans grossissement original septa, × indiquant mucormycose B, coloration immunohistochimique anti-Rhizopus est positive dans ces agrandissements d’origine hyphae, × indiquant mucormycose C, Gomori methenamine argent coloration montre de nombreuses hyphes avec aigu aiguillage grossissement original, × indiquant aspergillose D, Anti-Aspergillus coloration immunohistochimique est positive dans ces hyphae grossissement d’origine, × indiquant aspergilloseFigure View largeTéléchargement diapos photoméprésentatives de mucormycose et aspergillose A, Acide périodique- La coloration de Schiff montre des hyphes ramifiés typiques à angle droit sans grossissement original de septum, × indiquant une mucormycose B, la coloration immunohistochimique anti-Rhizopus est positive dans ces grossissements d’origine hyphae, × indiquant une mucormycose C, La coloration à l’argent de Gomori methenamine montre de nombreuses hyphes avec un grossissement original aigu de ramification d’angle, × indiquant l’aspergillose D, la coloration immunohistochimique d’Anti-Aspergillus est positive dans ces grossissements d’hyphae, × indiquant l’aspergillose

Précision du diagnostic histomorphologique de la mucormycose et de l’aspergillose

Nous avons déterminé l’exactitude du diagnostic histomorphologique des MP probables et IPA probable, en utilisant les tests IHC. Tableau Des patients avec PM probable, avaient une culture fongique positive des expectorations Cependant,% des patients avec PM probables dont les tests GM étaient disponibles avaient un sérum positif ou Résultats de l’OGM avec les PM probables,% présentaient une IHC mucormycose positive et% présentaient des résultats d’IHC d’aspergillose positifs Figure A, y compris avec les deux Les autres patients avaient des résultats d’IHC négatifs pour la mucormycose et l’aspergillose

Tableau Précision du diagnostic histomorphologique chez les patients atteints de mucoviscidose pulmonaire probable et d’aspergillose pulmonaire invasive probable Résultats Patients, non% P valeur Mucormycose n = Aspergillose n = Preuve mycologique Culture positive a b Test GM / & lt; Résultats sérum / / BAL fluide / / IHC Mucormycose seulement & lt; Aspergillose seulement & lt; Les deux sont positifs … Les deux sont négatifs … Résultats Patients, Non% P valeur Mucormycose n = Aspergillose n = Preuve mycologique Culture positive a b Test GM / & lt; Résultats sérum / / BAL fluide / / IHC Mucormycose seulement & lt; Aspergillose seulement & lt; Les deux positifs … Les deux négatifs … Abréviations: BAL, lavage broncho-alvéolaire, GM, galactomannane; IHC, immunohistochemistryaRhizopus spp ont été isolées à partir de la culture des expectorationsb Deux ont été isolées à partir de la culture des aspirats bronchiques, et de la culture des expectorationsView Large

Figure Vue largeTélécharger un échantillon de biopsie pulmonaire a été obtenu à partir d’une femme âgée en raison de l’hémoptysie récurrente et la suspicion de cancer du poumon qui n’avait pas d’antécédents médicaux remarquables Le rapport de pathologie a noté des caractéristiques morphologiques suggestives de mucormycose A-C, Gomori méthénamine agrandissement original, x montre des hyphes ramifiées à angle droit positives pour la coloration immunohistochimique anti-Aspergillus B; grossissement original, × mais négatif pour la coloration immunohistochimique anti-Rhizopus C; Un échantillon de biopsie pulmonaire a été prélevé chez un homme âgé de plusieurs années et ayant reçu une dose élevée de dexaméthasone pour un myélome multiple diagnostiqué un mois plus tôt. Le rapport de pathologie a noté des caractéristiques morphologiques suggérant une aspergillose D-F, Gomori méthénamine coloration à l’argent D; agrandissement original, x montre des hyphes à angle aigu aigu pour la coloration immunohistochimique anti-Aspergillus E; grossissement original, × mais positif pour la coloration immunohistochimique anti-Rhizopus F; grossissement original, × Figure View largeTélécharger la lameUn échantillon de biopsie pulmonaire a été obtenu auprès d’une femme âgée en raison d’une hémoptysie récurrente et de suspicion de cancer du poumon sans antécédents médicaux remarquables Le rapport de pathologie notait des caractéristiques morphologiques suggérant une mucormycose A-C, Gomori méthénamine coloration à l’argent A; agrandissement original, x montre des hyphes ramifiées à angle droit positives pour la coloration immunohistochimique anti-Aspergillus B; grossissement original, × mais négatif pour la coloration immunohistochimique anti-Rhizopus C; Un échantillon de biopsie pulmonaire a été prélevé chez un homme âgé de plusieurs années et ayant reçu une dose élevée de dexaméthasone pour un myélome multiple diagnostiqué un mois plus tôt. Le rapport de pathologie a noté des caractéristiques morphologiques suggérant une aspergillose D-F, Gomori méthénamine coloration à l’argent D; agrandissement original, x montre des hyphes à angle aigu aigu pour la coloration immunohistochimique anti-Aspergillus E; grossissement original, × mais positif pour la coloration immunohistochimique anti-Rhizopus F; Grossissement original, × Parmi les patients avec un IPA probable,% présentaient des résultats de culture positifs à partir d’échantillons non stériles tels qu’un liquide d’expectoration ou de BAL. Avec un IPA probable chez lequel des dosages GM étaient disponibles,% présentaient des résultats positifs pour le sérum ou le BAL. % avaient des résultats IHC de mucormycose positifs,% présentaient des résultats IHC de mucormycose positifs et des% étaient négatifs pour l’aspergillose et la mucormycose Parmi les patients avec un IPA probable pour lesquels les résultats IHC de mucormycose étaient positifs, aucun n’avait de culture fongique positive. Résultats positifs pour le sérum ou le BAL L’accord sur le diagnostic histomorphologique entre les pathologistes expérimentés est présenté dans le tableau. Les pathologistes ne sont pas d’accord dans les cas, et le pourcentage global d’accord était% κ =; excellent accord

Tableau Accord Diagnostic Histomorphologique Entre Pathologistes Expérimentés Diagnostic par Pathologiste Diagnostic par Pathologiste B, Non% de Patients Morphologie Morphologie Aspergillose Morphologique Morphologique Morphologique Morphologique Aspergillose Diagnostic Total par Pathologiste Diagnostic par Pathologiste B, No% de Patients Morphologie Mucormycose Aspergillose Morphologique Total Morphologique mucormycose Aspergillose morphologique Total a Le pourcentage global d’accord était de% κ = View Large

DISCUSSION

n-tazobactam, bien que les récentes préparations de pipéracilline-tazobactam ne semblent pas causer de résultats GM faussement positifs Une autre explication possible pourrait être une réaction croisée entre l’antigène mucormycose et l’OGM. Cette hypothèse est appuyée par patients atteints de mucormycose invasive , bien qu’aucune réactivité croisée n’ait été observée avec les surnageants de culture des agents de mucormycose Alternativement, Aspergillus peut coloniser les bronches endommagées chez les patients atteints de mucormycose Cette colonisation pourrait être responsable des tests GM positifs car nous avons montré que le dosage du sérum GM a souvent des résultats positifs chez les patients avec aspergillome simple sans invasion tissulaire manifeste Par conséquent, nous supposons que certains des cas classés comme IPA probables dans les études cliniques peuvent avoir été mal diagnostiqués et traités avec le voriconazole, avec des résultats indésirables , tous les patients ayant un IPA probable et des résultats de culture positifs non stériles ont eu des résultats positifs Tableau supplémentaire On peut déduire de ces données que le diagnostic morphologique combiné avec des résultats de culture non stérile est exact, mais le diagnostic morphologique sans résultats de culture doit être interprété avec prudence Bien que plus récent des méthodes telles que l’IHC, la coloration des anticorps fluorescents et l’hybridation in situ , peuvent compenser les limites du diagnostic morphologique, le diagnostic histomorphologique doit toujours être confirmé par la culture fongique Il est à noter que pour augmenter le rendement de la culture fongique, Les microbiologistes doivent hacher plutôt que moudre les tissus lors de la mise en place de cultures mycologiques, car le broyage donne un faible taux de culture pour la mucormycose. Cependant, si une culture n’est pas disponible ou ne peut être obtenue, ces méthodes plus récentes , conscients des limites du diagnostic histomorphologique, plusieurs auteurs ave a suggéré que les pathologistes devraient décrire les hyphes observés comparés aux caractères pauciséptés, hyalins vs pigmentés, plus morphologiques, suivis d’un commentaire indiquant les différents genres fongiques qui pourraient avoir ces caractéristiques morphologiques Cette étude a plusieurs limites gastro-intestinal. Premièrement, dans la pratique clinique réelle la plupart des cas d’IPA sont diagnostiqués et traités sur la base des résultats radiologiques et des résultats positifs de GM sans échantillons tissulaires. Par conséquent, le vrai diagnostic chez de nombreux patients ayant un IPA suspect nécessitant une biopsie tissulaire est incertain. Par conséquent, le fait que tous les patients atteints d’IPA probable dans cette étude ont subi une biopsie tissulaire peut avoir créé une sorte de biais de sélection, ce qui pourrait expliquer en partie la forte proportion de résultats IHC de mucormycose positive chez nos patients. pour déterminer l’exactitude du diagnostic histomorphologique des cas probables Il y avait trop peu de cas de mucormycose et d’aspergillose stériles en culture pour permettre l’évaluation des performances diagnostiques de la mucormycose et de l’aspergillose. Pour surmonter le nombre insuffisant de témoins, nous avons testé la réactivité croisée de l’IHC avec diverses infections fongiques et non fongiques. Nous avons également évalué la réactivité de l’aspergillose IHC et de la mucormycose IHC dans des cultures pures de différents champignons. La sensibilité de l’IHC d’Aspergillus était sous-optimale. Cependant, parmi les patients avec un IPA probable, les résultats de l’IHC de mucormycose positive ont été positifs. Par conséquent, la sensibilité sous-optimale de l’aspergillose IHC ne modifie pas le résultat principal de l’IPS. la limitation de la morphologie tissulaire dans le diagnostic de l’aspergillose s Quatrièmement, une sorte de réaction croisée de la mucormycose IHC et de l’aspergillose IHC a été notée dans les cultures pures de A fumigatus et C bertholletiae. Des patients présentant une mucormycose probable,% étaient positifs à la fois pour l’aspergillose et la mucormycose IHC. en raison d’une réaction croisée plutôt que d’une co-infection, bien qu’une étude ait décrit de multiples infections fongiques impliquant une aspergillose pulmonaire concomitante et une mucormycose De plus, lorsque les tests IHC montrent une réaction Aspergillus positive et que le champignon semble compatible avec la mucormycose, Il est difficile d’établir un diagnostic définitif Le développement de tests IHC fongiques plus sensibles et spécifiques apportera des réponses définitives à cette situation complexe. En conclusion, nos données montrent que la morphologie tissulaire est peu utilisée dans le diagnostic de l’aspergillose. , les tests IHC semblent être utiles pour différencier l’aspergillose et le mucormycos est

Remarques

Soutien financier Ce travail a été soutenu par la Fondation nationale de recherche de la Corée NRF-RAAA et Asan Institute for Life Sciences – Conflits d’intérêts potentiels Tous les auteurs: Aucun conflit signaléTous les auteurs ont soumis le formulaire ICMJE pour la divulgation des conflits potentiels Conflits d’intérêts que le les éditeurs considèrent pertinent au contenu du manuscrit ont été divulgués