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Diagnostic en laboratoire des pneumococcies invasives

Le diagnostic en laboratoire de pneumococcie invasive IPD continue à s’appuyer sur des méthodes culturales utilisées depuis plusieurs décennies. Les développements les plus significatifs ont été les tests de détection d’antigènes, alors que le rôle des tests d’amplification des acides nucléiques reste à clarifier. Les limites des tests diagnostiques existants ont un impact sur la capacité à obtenir des données précises sur la charge de DPI et à évaluer l’efficacité des mesures de contrôle, telles que la vaccination, le diagnostic microbiologique et le diagnostic microbiologique dans la plupart des cas de pneumococcie pneumococcique. En plus de la capacité de diagnostiquer la PI chez des patients individuels Il y a un besoin urgent d’améliorer les tests de diagnostic de la maladie pneumococcique – en particulier les tests qui conviennent à une utilisation dans les pays insuffisamment développés

Streptococcus pneumoniae le pneumocoque est l’un des agents pathogènes humains les plus importants Il est une cause majeure de pneumonie, méningite, bactériémie, sinusite et otite moyenne, et il infecte parfois des tissus à d’autres sites. Le pneumocoque invasif désigne la pneumonie, la méningite L ‘Organisation mondiale de la Santé estime que 16 millions de personnes, dont 1 million d’ enfants âgés de moins de 5 ans, meurent chaque année d ‘une pneumopathie interstitielle [1], les pays en développement Le plus grand fardeau [2] Avec la disponibilité d’un vaccin conjugué efficace [3-6], IPD est également la principale cause de décès parmi les maladies infectieuses évitables par la vaccination [7] Malgré son importance, IPD en particulier la pneumonie pneumococcique peut être étonnamment difficile à confirmer microbiologiquement Dans un commentaire éditorial récent, Bartlett [8] a souligné la diminution des tests microbiologiques dans le Au lieu d’avoir développé des tests plus rapides, définitifs et concluants pour diagnostiquer la pneumonie, nous semblons faire moins bien que les scientifiques il y a 70 ans. En ce qui concerne la pneumonie à pneumocoque, Bartlett conclut que « soit le pneumocoque est en train de disparaître, soit la microbiologie disparaître « [8, p 170] Une partie au moins de ce phénomène est probablement due à un changement de l’accent mis sur la détection microbienne, avec un seuil plus élevé pour la réalisation de tests microbiologiques et moins d’attention pour obtenir des échantillons de haute qualité. pneumocoques est une raison fondamentale pour les efforts accrus pour cultiver pneumococciIsolation de S pneumoniae d’un site corporel normalement stérile fournit des preuves concluantes d’infection pneumococcique, mais cela est réalisé pour seulement une minorité de cas de pneumonie pneumococcique IPD, la manifestation la plus courante de IPD, peut être particulièrement difficile à diagnostiquer Ceci est en grande partie le résultat des problèmes liés à o L’utilisation préalable d’antibiotiques réduira également significativement la capacité d’isoler S pneumoniae des échantillons cliniques Malgré l’importance mondiale de la pneumococcie, il y a eu étonnamment peu de cas récents d’infection à pneumocoque. Les difficultés de diagnostic des IPD ont des ramifications qui vont bien au-delà de la possibilité de diagnostiquer les IPD chez les patients individuels. La capacité à obtenir des données précises sur la charge IPD et à évaluer l’efficacité de la vaccination est entravée par les limites des tests diagnostiques existants coagulation. Le diagnostic d’IPD repose actuellement sur des méthodes ou des variations de méthodes qui existent depuis plusieurs décennies

Microscopie et culture

L’identification en laboratoire des isolats de S pneumoniae repose sur la reconnaissance des caractéristiques morphologiques typiques et sur les résultats de quelques tests phénotypiques. Au cours de l’évaluation microscopique, S pneumoniae apparaît sous la forme de diplocoques à gram positif ou de chaînes de cocci. microscopistes, ces caractéristiques ont une haute spécificité pour la présence de S pneumoniae et doivent être signalées comme telles. Cependant, les apparences typiques peuvent être altérées par une thérapie antimicrobienne, et une décoloration excessive de la coloration peut donner la fausse impression qu’elles sont des diplocoques Gram négatif. rarement utilisée de nos jours, la réaction de quellung est une méthode plus spécifique pour la détection du pneumocoque à partir de cultures pures ou d’échantillons d’expectoration [9, 10] Après réaction du pneumocoque avec des antisérums anticapsulaires streptococciques, la capsule pneumococcique devient visuellement améliorée. entouré par un halo figure 2 Bien que la réaction d’étouffement est générée Considérés comme hautement spécifiques du pneumocoque, des réactions croisées ont été rapportées avec d’autres polysaccharides streptococciques [11], et des souches non encapsulées produiront des résultats faussement négatifs.

Figure 1Voir un grand échantillonTaille de coloration d’un échantillon d’expectoration montrant Streptococcus pneumoniae en tant que diplocoque à Gram positif Figure 1Voir un grand échantillon en microscopie à haute résolution d’un échantillon d’expectoration montrant Streptococcus pneumoniae sous forme de diplocoques à Gram positif

Figure 2View largeDownload slideQuellung réaction, montrant à la fois positive pour Streptococcus pneumoniae et des résultats négatifsFigure 2View largeDownload slideQuellung réaction, montrant à la fois positif pour Streptococcus pneumoniae et des résultats négatifsAprès une nuit à 35 ° C avec 5% de CO2 sur 5% agar sang de Les colonies de pneumoniae semblent petites, grisâtres et mucoïdes et sont entourées d’une zone verdâtre d’α-hémolyse. Après 24-48 h d’incubation, les colonies deviennent des colonies «dessinateurs» au centre. Figure 3 Une identification supplémentaire est importante pour confirmer l’identité. La différenciation entre S pneumoniae et les autres streptocoques viridans est généralement réalisée par 2 réactions clés: susceptibilité à l’optochine et solubilité biliaire L’ophtaline éthylhydrocupréine est un agent antibactérien non utilisé sur le plan thérapeutique mais utilisé pour l’identification en laboratoire des streptocoques. Le test de solubilité biliaire repose sur l’autolyse de S pneumoniae en présence de l’agent tensio-actif désoxycholate de sodium, les isolats de S pneumoniae sont typiquement sensibles à l’optochine et sont biliaires solubles, tandis que les autres streptocoques viridans sont typiquement résistants à l’optochine et insolubles biliaires Bien que la solubilité biliaire soit généralement considérée comme très sensible et spécifique pneumoniae, la découverte que jusqu’à 10% des isolats de S pneumoniae peuvent être résistants à l’optochine réduit le recours à ce dernier test [12] Par conséquent, les isolats suspects présentant une sensibilité réduite à l’optochine doivent également être testés pour leur solubilité biliaire. , et les tests d’hybridation de sonde ADN sont des méthodes alternatives pour l’identification rapide des isolats de S pneumoniae [12, 13] Toutes ces méthodes sont très sensibles mais produisent parfois des résultats positifs avec d’autres lignées de streptocoques viridans, 85% -95% [12, 14]

capsule occale, insolubilité dans la bile, résistance ou susceptibilité indéterminée à l’optochine en incubation dans 5% de CO2 mais susceptibilité à l’optochine en incubation dans l’air ambiant et réactions positives avec hybridation sonde ADN et tests de détection d’antigènes [15, 16] pseudopneumoniae est encore incertain, bien qu’il puisse y avoir une association avec la maladie pulmonaire obstructive chronique [16] Cultures sanguines L’isolement de S pneumoniae de l’hémoculture fournit un diagnostic définitif de pneumococcie Cependant, bactériémie documentée se produit dans une minorité de cas de IPD S pneumoniae est considéré comme la cause la plus fréquente de pneumonie communautaire dans tous les groupes d’âge, les taux d’hémocultures positives pour les adultes hospitalisés avec une pneumonie sont généralement seulement de 3% -8% [17-20] et sont plus faibles chez les enfants [21] , 22] Dans la méningite pneumococcique, la bactériémie documentée se produit plus fréquemment que dans la pneumonie, et les taux de résultats positifs rapportés sont souvent> 50% [23, 24] Les taux relativement peu documentés de bactériémies chez les patients atteints de PI impliquent plusieurs facteurs, y compris l’administration préalable d’antimicrobiens et la nature intermittente de l’invasion sanguine par S pneumoniae En outre, S pneumoniae libère l’autolysine pendant la phase de croissance stationnaire, entraînant la mort cellulaire et rendant difficiles les méthodes traditionnelles de croissance bactérienne sur les milieux, comme l’hémoculture, [25] Examen du LCR Pour le diagnostic de méningite pneumococcique, la combinaison de coloration de Gram et de culture bactérienne d’échantillons de LCR permettra d’identifier Dans une grande revue, les frottis de coloration de Gram des échantillons de LCR détectés S pneumoniae avec une sensibilité de 84% et une spécificité de 98%, mais l’administration préalable d’antibiotiques réduisait significativement le rendement pour le frottis et la culture de Gram [23]. pour la culture dès que possible est essentiel pour la performance de culture optimale, parce que la viabilité bactérienne diminue au fil du tempsSputum examinat En l’absence de bactériémie documentée, le diagnostic de pneumonie pneumococcique peut être difficile, en particulier chez les enfants qui ne produisent pas d’expectoration. La démonstration microscopique de nombreux diplocoques gram positifs dans un échantillon d’expectoration contenant plus de 10 cellules épithéliales épidermoïdes SEC et> 25 des cellules PMN polymorphonucléaires par grossissement de champ de faible puissance, × 100 [26] ou ⩾10 leucocytes pour chaque SEC [27] pour un patient souffrant de pneumonie est fortement évocatrice de pneumonie pneumococcique Ceci est davantage soutenu si S pneumoniae est l’isolat prédominant dans des cultures de Échantillons d’expectoration Des échantillons d’expectoration de qualité médiocre, contenant un nombre relativement faible de cellules PMN et un nombre élevé de cellules SEC, ne devraient pas être traités, car ils représentent probablement une flore oropharyngée commensale. Un système d’évaluation de la qualité des expectorations est précieux et coûteux. -un outil efficace qui permet au laboratoire de microbiologie de maintenir des résultats cliniquement pertinents Dans ce contexte, il est utile de se rappeler La variabilité intra et intertechnologique dans le processus d’évaluation de la qualité des spécimens a été rapportée et pourrait expliquer certaines des sensibilités variées des échantillons d’expectoration colorés par Gram pour la détection des pneumocoques [28, 29]. Plusieurs études cliniques ont montré que Les colorations de Gram sont toujours utiles pour le diagnostic de la pneumonie pneumococcique, tant que les échantillons sont de haute qualité et, idéalement, obtenus avant l’administration de l’antibiothérapie ou jusqu’à 24 h après le début du traitement [27, 30, 31]. une étude prospective a révélé que des échantillons d’expectoration de haute qualité peuvent être prélevés chez une proportion importante d’adultes atteints de pneumonie communautaire et que la coloration de Gram de l’expectoration était de 57% et de 97% pour le diagnostic de pneumonie pneumococcique [31] la pneumonie à pneumocoque chez l’adulte, la coloration de Gram des expectorations et la culture ont des sensibilités de 80% et de 93%, respectivement, si un spécimen adéquat a été produit avant la thérapie [27] La ​​raison pour laquelle les cultures d’expectorations ont montré des sensibilités variables dans différentes études n’est pas nécessairement l’inadéquation de l’outil microbiologique lui-même; Elle peut être le résultat de divers facteurs, tels que le retard de traitement d’un échantillon d’expectoration ou le traitement d’un échantillon inadéquat, l’incapacité du patient à produire un échantillon d’expectoration et l’administration d’un traitement antimicrobien avant d’obtenir un échantillon. potentiel d’amélioration du rendement diagnostique de la pneumonie pneumococcique, en particulier chez les personnes présentant de grandes lésions périphériques, y compris chez les enfants qui ne produisent pas d’expectoration [32-34] Il s’agit d’une procédure relativement sûre si elle est pratiquée par un personnel expérimenté. être largement adopté en raison de sa nature envahissante et des préoccupations au sujet des complications Les poumons moins conformes des personnes âgées sont plus sujets aux pneumothorax après l’intervention, et les patients sous anticoagulation peuvent saigner

Tests de détection d’antigène

La détection de l’antigène pneumococcique dans des échantillons cliniques – en particulier des échantillons d’urine – remonte au moins à 1917 [35] Au cours des dernières décennies, des tests commerciaux d’agglutination au latex ciblant les antigènes polysaccharidiques capsulaires de S pneumoniae ont été largement utilisés. Dans une grande étude, la sensibilité d’un test d’agglutination au latex était élevée pour la détection de S pneumoniae dans des échantillons de LCR, mais tous les échantillons qui ont donné des résultats positifs ont également démontré En outre, les résultats faussement positifs étaient fréquents, en particulier pour les échantillons d’urine, pour lesquels les résultats les plus positifs étaient erronés. Cependant, les tests d’agglutination au latex ont toujours permis de diagnostiquer la pneumonie pneumococcique et la méningite dans les communautés limitées. installations de laboratoire [37, 38] Le développement récent d’un immunochrome rapide test tographique ICT qui détecte l’antigène de la paroi cellulaire de polysaccharide C commun à toutes les souches de S pneumoniae NOW S pneumoniae test d’antigène urinaire; Binax a renouvelé son intérêt pour la détection des antigènes On peut dire que ce test a été le seul progrès majeur dans le diagnostic des pneumocoques ces dernières années. Si appliqué aux échantillons d’urine, ce test a une sensibilité de 70% à 80% et une Dans toutes les études, une proportion de patients avec des résultats positifs de culture de sang ou d’expectoration ont des résultats de test NOW négatifs. Par conséquent, le test NOW doit être utilisé en conjonction avec d’autres méthodes d’essai. Le résultat du test peut rester positif pendant plusieurs semaines [41, 45] et la vaccination antipneumococcique peut produire des réactions faussement positives [46] L’utilité du test NOW pour les enfants est encore définie en raison du taux élevé de faux positifs enfants, qui résulte de la colonisation nasopharyngée avec S pneumoniae [47-49] D’autres limites de l’essai sont son coût relativement élevé et l’incapacité de fournir antimicrobien su données de sceptibilité Des études récentes ont montré que le test NOW peut être utilisé pour soutenir le traitement par antibiotiques à β-lactamines à spectre étroit contre la pneumonie chez l’adulte, prévenant ainsi l’utilisation inutile d’une thérapie à large spectre [50, 51] pour tester des échantillons d’urine, le test NOW a été utilisé avec succès avec des échantillons d’autres fluides corporels. Le test est particulièrement utile pour le diagnostic rapide de méningite pneumococcique avec utilisation d’échantillons de LCR, avec une sensibilité de 95% à 100% et une spécificité de 100 Il a également été utilisé avec succès avec des échantillons de liquide pleural provenant d’enfants et d’adultes atteints de pneumonie [54, 55] Avec des échantillons de liquide de lavage bronchoalvéolaire, l’antigène pneumococcique a pu être détecté avec une sensibilité de 95% et une spécificité de 87 % [56] Le test NOW peut également fournir une identification provisoire rapide de S pneumoniae dans les hémocultures avec des résultats positifs [25] D’autres antigènes pneumococciques – en particulier, le pneumolyse sin-ont été étudiés comme cibles diagnostiques potentielles La détection de l’antigène de pneumolysine a été appliquée aux échantillons d’urine [57-59] et de CSF [60] Les résultats ont été prometteurs, mais ils doivent encore être démontrés comme supérieurs au polysaccharide C de la paroi cellulaire dosage [57] Il est possible que la combinaison d’un test ELISA de détection d’antigène spécifique à la pneumolysine avec le test NOW conduise à un meilleur rendement diagnostique, en raison de la spécificité plus élevée de l’ELISA de détection de la pneumolysine [58]

Tests de détection d’anticorps

La détection des anticorps antipneumococciques ou des immuncomplexes a été utilisée pour le diagnostic de pneumococcie dans certains contextes de recherche [61-64], mais ils n’ont jamais été largement utilisés. Ces tests souffrent de problèmes inhérents à la plupart des tests sérologiques, dont la sensibilité et la spécificité suboptimales. bien être limité par le temps qu’il faut pour démontrer la séroconversion

Tests d’amplification d’acide nucléique

Les tests d’amplification des acides nucléiques, tels que la PCR, se sont imposés comme outils diagnostiques importants et sont maintenant représentatifs de l’actuel zeitgeist microbiologique. Leur attractivité dans un laboratoire de diagnostic provient des attributs suivants: ils peuvent détecter des quantités infimes d’acide nucléique potentiellement pathogène , ils ne dépendent pas de la viabilité du microbe cible, ils sont probablement moins affectés par un traitement antimicrobien antérieur que les méthodes basées sur la culture, et ils fournissent des résultats dans un court laps de temps À ce jour, les tests d’amplification des acides nucléiques ont des performances variables pour le diagnostic IPD Dans le cadre d’une pneumonie, la sensibilité de détection de S pneumoniae dans les échantillons sanguins est comprise entre 29% et 100% [65], bien que la performance soit meilleure chez les enfants que chez les adultes. PCR dans les échantillons de sang peut être en raison de la clairance rapide de la S pneumoniae de la circulation sanguine et sampli En outre, des résultats positifs de PCR pneumococcique ont été enregistrés chez des sujets témoins asymptomatiques [66-68], et ces résultats ne sont pas faciles à expliquer. Lors de l’analyse d’échantillons d’expectorations, les taux de positivité rapportés par PCR ont varié de 68% à 100% pour les échantillons provenant de patients atteints de pneumonie [65], bien qu’on ne sache pas à quelle fréquence cela reflète la colonisation des voies respiratoires supérieures [69] Ceci est une préoccupation particulière étant donné la présence du gène de la pneumolysine, un Certains tests de PCR, y compris l’utilisation de cibles multiples, ont augmenté la spécificité [70], avec des tests lytA offrant potentiellement des avantages par rapport aux autres tests [71] Certains chercheurs ont suggéré cette PCR quantitative peut aider à distinguer la colonisation de l’infection, avec une charge bactérienne plus élevée dans les IPD que dans un état porteur Althou Ces données initiales suggèrent que cela pourrait valoir la peine d’être approfondi [72] Une étude récente menée au Malawi a montré que des charges élevées d’ADN pneumococcique dans le sang et le LCR étaient associées à une issue fatale chez les enfants atteints de PI [73]. La pneumonie à pneumocoque, la détection d’ADN pneumococcique dans les échantillons de LCR peuvent être utiles pour diagnostiquer la méningite à pneumocoque. Cela n’est peut-être pas surprenant étant donné la concentration bactérienne élevée dans le LCR en présence de méningite et les risques de contamination par les bactéries colonisatrices. évalué de manière approfondie, la sensibilité et la spécificité de la PCR appliquée aux échantillons de liquide céphalorachidien sont élevées pour le diagnostic de la méningite à pneumocoque 92% -100% et 100%, respectivement, et cette découverte a été démontrée dans divers contextes [74-78] également été utilisé avec succès avec d’autres échantillons obtenus par des moyens invasifs, tels que des échantillons de liquide pleural [79, 80] et d’aspiration pulmonaire [81]

Perspectives d’avenir

Quel avenir pour le diagnostic du pneumocoque? Il n’existe toujours pas de moyen facile d’établir le diagnostic de pneumopathie interstitielle, et il y a eu relativement peu de développements majeurs dans les diagnostics de laboratoire ces dernières décennies. La promesse des méthodes d’amplification des acides nucléiques n’a pas encore été réalisée. IPD, et le problème de la différenciation entre colonisation et infection pour la pneumonie reste prédominant. Le test de détection antigénique NOW est un ajout bienvenu, bien qu’il présente encore des limites, en particulier pour le diagnostic de pneumonie chez les enfants. intention d’optimiser leur utilisation On a tendance à minimiser le rôle des tests diagnostiques pour la pneumonie, et sans aucun doute les méthodes traditionnelles microscopiques et culturales auraient un rendement accru si l’on prenait plus soin de recueillir des échantillons appropriés au bon moment. orientée vers le développement de nouveaux outils de diagnostic pour IPD La recherche d’autres antigènes pneumococciques à utiliser à des fins diagnostiques devrait être poursuivie Des efforts considérables ont été déployés pour déterminer de bonnes cibles de vaccination pour les DPI. Ces cibles englobent souvent les mêmes critères que pour un objectif diagnostique. sont associés à la capsule pneumococcique en raison de sa variabilité. Il en va de même pour les cibles diagnostiques. Cette hypothèse est corroborée par le succès du polysaccharide C de la paroi cellulaire en tant qu’antigène utile dans le test NOWNous n’avons pas encore complètement exploré l’utilisation des outils diagnostiques établis, tels que les tests de détection d’antigènes et les méthodes moléculaires, dans le cadre de nouvelles stratégies diagnostiques ou en combinaison avec des techniques plus expérimentales telles que la PCR-spectrométrie de masse. Développements dans le domaine de l’identification bactérienne par des échantillons d’haleine ou de profilage de masse par spectrométrie de masse peuvent ouvrir n De nouvelles pistes de diagnostic dans le futurLes diagnostics de PI doivent être développés dans le contexte de la pneumonie et de la méningite en général, reconnaissant que d’autres agents pathogènes responsables de pneumonie et de méningite sont également difficiles à identifier. Enfin, il est primordial de ne jamais perdre de vue Le diagnostic microbiologique doit être rapide, bon marché, facile à utiliser et utile à des fins de surveillance. Pour diagnostiquer avec succès le DPI dans les pays insuffisamment développés

Remerciements

Nous remercions David Beckingham pour son aide avec les photographies Conflits d’intérêts potentiels DRM et AW: no conflicts