Menu

Japan Week Spokane

Réaction en chaîne de la polymérase à base de réactifs secs par rapport à d’autres méthodes de laboratoire disponibles pour le diagnostic de la maladie de l’ulcère de Buruli

Contexte En raison de la présentation clinique à multiples facettes de l’ulcère de Buruli, une classification erronée des cas cliniquement diagnostiqués peut être fréquente. Les examens de laboratoire pour la confirmation des cas suspects incluent l’examen microscopique, la culture, la PCR et l’examen histopathologique. habituellement disponible dans les zones d’endémicité, a une faible sensibilité Méthodes Pour rendre une méthode de diagnostic hautement sensible localement disponible, la PCR DRB-PCR à base de réactif sec, qui est bien adaptée aux conditions tropicales, a été testée au Ghana. pour le diagnostic de routine de l’ulcère de Buruli sur une période de plusieurs années La méthode a été comparée avec d’autres tests diagnostiques pour évaluer sa performance dans des conditions de terrain. Résultats Le taux de concordance entre DRB-PCR et PCR standard était de% pour les échantillons sur écouvillon. tous les tests disponibles localement, DRB-PCR a révélé la rapport de positivité global le plus élevé Soixante pour cent des patients présentant un diagnostic clinique d’ulcère de Buruli ont été diagnostiqués par DRB-PCR d’écouvillonnages ou de prélèvements tissulaires, contre% -% de patients diagnostiqués par examen microscopique d’écouvillons ou de tissus. Le ratio DRB-PCR variait considérablement selon l’analyse par centre de traitement La standardisation de la collecte des échantillons a entraîné une augmentation du pourcentage de positivité du test, comparé à celui de la phase de test pilote. Conclusion Le DRB-PCR est un outil fiable pour le diagnostic de Buruli maladie de l’ulcère Cependant, les tests de PCR ne sont appropriés pour la détection que pendant les stades précoces de la maladie, lorsque les échantillons contiennent encore des bacilles. La qualité du diagnostic clinique et la qualité des échantillons de diagnostic influencent fortement le taux de positivité.

Ulcère de Buruli BUD est une maladie infectieuse causée par Mycobacterium ulcerans qui implique la peau et le tissu adipeux sous-cutané. Dans la majorité des cas, la maladie commence par une papule indolore, plaque ou nodule qui évolue vers une ulcération importante avec des bords minés caractéristiques. En raison de la présentation clinique à multiples facettes, une classification erronée des cas cliniquement diagnostiqués de BUD peut survenir fréquemment. Après la tuberculose et la lèpre, le BUD est devenu la troisième maladie mycobactérienne la plus fréquente chez les humains immunocompétents dans le monde, et l’incidence des lésions L’incidence et la prévalence de l’IUN dans le monde ne sont pas définies avec précision, car les données de surveillance adéquates basées sur des données de confirmation de cas précises manquent Jusqu’à présent, le contrôle des maladies dans les pays où le BUD est endémique se limite à surveillance active et s excision des lésions suivie d’une greffe cutanée [,,,, -] La confirmation en laboratoire des cas suspects évite les erreurs de classification, assure un traitement adéquat et fournit des données d’incidence et de prévalence fiables qui, à leur tour, peuvent soutenir le développement de nouvelles stratégies de lutte Les tests de laboratoire disponibles incluent la détection microscopique des bacilles acido-résistants dans les frottis et frottis tissulaires, l’analyse PCR et la culture des écouvillons et des tissus, et l’examen histopathologique. La sensibilité de l’examen microscopique des frottis et de la culture est relativement faible. sensibilités, sauf pendant la phase de guérison de la maladie Cependant, ces derniers tests diagnostiques sont rarement disponibles dans les pays où le BUD est endémique. En particulier, l’application des techniques de PCR dans les régions tropicales présente des difficultés techniques. interrompu par une puissance fréquente En outre, les tests PCR conventionnels nécessitent une manipulation soigneuse des composants de la réaction par des techniciens qualifiés, ainsi que des mesures strictes pour éviter la contamination. Pour faciliter le diagnostic PCR de l’IUN dans les pays où la maladie est endémique, PCR DRB-PCR a été installé et testé par des essais pilotes au Centre de Recherche Collaborative en Médecine Tropicale de Kumasi, Kumasi, Ghana. Parce que la méthode utilise des réactifs lyophilisés, elle est bien adaptée aux conditions tropicales [, ,,, -] Par la suite, sur une période de l’étude de la performance de la méthode dans des conditions de terrain et une comparaison avec d’autres méthodes de diagnostic, y compris la PCR standard utilisée selon Stinear et al , a été réalisée

Matériaux et méthodes

Dédouanement éthique et consentement éclairé du patient L’autorisation éthique de l’étude a été fournie par le Comité de recherche sur la recherche humaine et l’éthique à l’École des sciences médicales de l’Université des Sciences et Technologies de Kumasi au Ghana. Pendant la période d’étude janvier-janvier, tous les patients qui avaient reçu un diagnostic clinique d’IUN et qui avaient des lésions prulceratives ou ulcératives et une durée de la maladie de & lt; mois « lésions précoces » ont été inclus dans les centres de traitement suivants: Agogo Presbyterian Hospital Agogo, District Asante Akim Nord, Région Ashanti; hôpital A, hôpital gouvernemental de Dunkwa Dunkwa-on-Offin, district de Upper Denkyira, région du Centre; l’hôpital D, l’hôpital Goaso Goaso, le district d’Ahafo Ano, la région de Brongh Ahafo; l’hôpital G et l’hôpital catholique St Martin d’Agroyesum, district d’Amansie Ouest, région d’Ashanti; Laboratoires et tests AGDiagnostic hospitaliers L’examen microscopique, la culture et la DRB-PCR ont été réalisés en série au Centre Kumasi de Recherche Collaborative en Médecine Tropicale de Kumasi au Ghana et à l’Université Kwame Nkrumah de Science et Technologie de Kumasi au Ghana. l’Institut Bernhard Nocht de médecine tropicale Hambourg, Allemagne, et la PCR standard ont été réalisées au Département des maladies infectieuses et de médecine tropicale de l’Université Ludwig-Maximilians de Munich Munich, Allemagne Des échantillons diagnostiques ont été envoyés et testés par lots En cas de lésion ulcéreuse, d’écouvillons diagnostiques testés par examen microscopique, culture, PCR-DRB, PCR standard et échantillons de tissus testés par examen microscopique, culture, DRB-PCR, PCR standard, et son examen topathologique En cas de lésions prophylactiques, des prélèvements tissulaires testés par examen microscopique, culture, PCR DRB, PCR standard et examen histopathologique ont été soumis à une analyse de laboratoire. Des écouvillons ont été prélevés en entourant tout le bord miné des ulcères avant la chirurgie. Pour les lésions pré-ulcératives, les spécimens de tissu ont été prélevés au centre de la lésion en les coupant longitudinalement et transversalement en segments égaux. Les spécimens de tissu pour les lésions ulcératives ont été obtenus à partir du bord de la lésion. Des échantillons de tissus pour différents tests de laboratoire ont été placés adjacents les uns aux autres pour garantir une comparabilité maximale des résultats de tous les tests de diagnostic. Les échantillons de tissus devaient contenir du tissu adipeux sous-cutané pour être inclus dans le tissu adipeux sous-cutané. analyse Pour prov Des conditions optimales pour le stockage et le transport des échantillons, des sacs normalisés pour la collecte des échantillons contenant tous les articles et contenants nécessaires, ainsi que des formulaires normalisés pour la saisie des données de laboratoire ont été distribués aux hôpitaux. conduit sont présentés dans le tableau En utilisant les médias présentés dans le tableau, les échantillons de diagnostic pourraient être stockés pendant un minimum de mois à température ambiante jusqu’à un traitement ultérieur

Tableau View largeTéléchargement de diapositivesModèles diagnostiques, moyens de transport et tests diagnostiquesTable View largeTélécharger DiapositivesDiagnostic, milieux de transport et tests de diagnosticDiagnostic appliqué Tous les réactifs ont été stockés et utilisés conformément aux instructions du fabricantCulture, examen microscopique et examen histopathologique Echantillons de tissus écouvillon et broyés ont été décontaminés par la méthode Petroff, inoculés sur milieu Löwenstein-Jensen et incubés à ° C pendant des mois Écouvillons et frottis tissulaires pour examen microscopique préparés à partir de matériel décontaminé et colorés à la technique de Ziehl-Neelsen Examen histopathologique des prélèvements tissulaires L’ADN PCR des écouvillons et des échantillons tissulaires a été préparé à l’aide du kit d’isolation ADN Puregene Kit de purification d’ADN génomique, Gentra Systems, avec des modifications mineures Pour la DRB-PCR, les oligonucléotides MU et MU ont été lyophilisés réaction tubes PCR Ready-To-Go PuReTaq Amersham Biosciences ont été ajoutés et dissous dans l’eau La stabilité des amorces jusqu’à l’année a été contrôlée par des réactions de contrôle positif PCR standard a été réalisée conformément à Stinear et al Contrôle de l’extraction et contrôles positifs, négatifs et d’inhibition Le protocole de cyclage thermique était le suivant: ° C pour min, suivi de cycles à ° C pour s, ° C pour s, et ° C pour s, avec un cycle final à Les produits d’amplification ont été maintenus à ° C jusqu’à ce qu’ils soient traités par électrophorèse sur gel d’agarose. Spécificité des méthodes PCR La validation des amorces par l’algorithme BLAST et le test des espèces mycobactériennes et d’autres organismes par PCR ont abouti à un% de spécificité de la PCR standard. amorces, profils de cycles thermiques, et conditions de réaction comparables prédites% spécificité de la DRB-PCR Nos propres données de validation technique sur les espèces mycobactériennes Les patients ayant reçu un diagnostic clinique de BUD ont été opérés Quarante patients de l’hôpital A avaient déjà reçu un traitement antibiotique à court terme, durée moyenne, jours Trois cent cinquante prélèvements de patients ayant reçu un diagnostic clinique. les diagnostics de BUD dans différents hôpitaux et les patients avec des cas suspects sur le terrain des patients avec des lésions ulcéreuses et des patients avec des lésions prulceratives ont été soumis à une analyse de laboratoire. Les lésions prophylactiques consistaient en nodules, papules et plaques. analysé par examen microscopique, culture, PCR DRB et PCR standard; les échantillons de tissus ont été soumis à une table d’examen histopathologique

Tableau View largeDownload slideDistribution des lésions prulcératives et ulcératives par centre de traitementTable View largeTélécharger la diapositiveDistribution des lésions préulcératives et ulcératives par centre de traitementParamètres déterminés Pour déterminer les taux d’accord interassay définis comme les taux d’accord entre DRB-PCR et PCR standard, échantillons sur écouvillon des lésions ulcératives et adjacentes des échantillons de tissus de lésions ulcératives et prophylactiques ont été soumis à DRB-PCR au Centre de Recherche Collaborative en Médecine Tropicale de Kumasi et PCR standard au Département des Maladies Infectieuses et de Médecine Tropicale de l’Université Ludwig-Maximilians de Munich. comme le pourcentage de résultats concordants par type d’échantillon et par type de lésion et ont été exprimés en taux d’accord global et taux d’accord par centre de traitement. Le taux de positivité a été défini comme la proportion d’échantillons parmi tous les spécimens testés qui ont donné p résultats positifs par une certaine méthode de diagnostic Le rapport de positivité global de DRB-PCR a été comparé à celui de PCR, examen microscopique, culture et examen histopathologique standard. Pour déterminer les facteurs hospitaliers pouvant influencer la qualité du diagnostic de laboratoire, le taux de positivité de chaque méthode d’essai a été déterminée par centre de traitementAnalyse statistique Pour l’analyse statistique, tests χ tests approximatifs et tests exacts Les tests exacts de Fisher ont été réalisés avec le logiciel Stata, version Stata Analyse statistique% IC considéré comme le plus petit nombre d’échantillons histopathologiques

Résultats

Taux d’accord entre le DRB-PCR et le taux d’accord inter-essai PCR standard global et par hôpital Comme indiqué dans le tableau, le taux d’accord global entre DRB-PCR et PCR standard était de% P & lt; pour les échantillons sur écouvillon et% P & lt; Pour tous les échantillons de tissus, le tableau indique également les taux d’accord inter-essai entre DRB-PCR et PCR standard par hôpital. Les taux d’accord inter-essai pour les centres A et D étaient respectivement de% et% pour les échantillons sur écouvillon et% et% pour les échantillons tissulaires

Table View largeTéléchargement de diapositives Taux de concordance d’essai entre la PCR DRB-PCR et les taux de concordance par centre de traitementTable View largeTélécharger la diapositiveTarifs de concordance entre la PCR DRB-PCR et les taux de concordance Le rapport global de positivité de DRB-PCR par rapport à tous les autres tests de diagnostic effectués Le rapport de positivité globale de DRB-PCR des écouvillons et des échantillons de tissus était de%, et le rapport de positivité global de la PCR standard des échantillons sur écouvillon et des échantillons de tissus était de% et%, respectivement. Rapports de positivité globaux pour les autres tests de diagnostic allant du% de culture de spécimens sur écouvillon à% d’analyse histopathologique de spécimens tissulaires

Table View largeTéléchargement diapositiveTaux de rétention par centre de traitement et ratios de positivité globaux par type de spécimenTable View largeDownload slideRatios de toxicité par centre de traitement et ratios de positivité globaux par type d’échantillonRapport de sensibilité de toutes les méthodes de diagnostic par table de centre de traitement montre également les ratios de positivité de DRB-PCR par rapport à toutes les autres méthodes de test diagnostique, par centre de traitement DRB-PCR des échantillons sur écouvillon a fourni les ratios de positivité les plus élevés aux centres de traitement A, AG et D%,% et%, respectivement, et DRB-PCR des échantillons de tissus Le rapport de positivité le plus faible de DRB-PCR des échantillons de tissus a été détecté au centre D% Diagnostic différentiel par examen histopathologique Parmi tous les spécimens, BUD a été confirmé dans les spécimens et exclu dans les spécimens, par examen histopathologique Un diagnostic alternatif était disponible pour les patients chez qui l’on avait confirmé Le patient atteint de la lèpre a eu la lèpre; les patients avaient un abcès bactérien, granulomateux ou non spécifique; les patients avaient une ulcération chronique ou bactérienne de la peau; les patients avaient des infections parasitaires [de ces infections étaient l’onchocercose]; les patients avaient une inflammation non spécifique; les patients avaient une dermatite non spécifique, chronique ou aiguë; le patient avait une fibrose; Le tableau compare les résultats de la DRB-PCR avec ceux de l’examen histopathologique des échantillons confirmés par examen histopathologique. Les frottis positifs pour les bacilles acido-alcoolo-résistants ont donné des résultats positifs. spécimens et résultats négatifs pour ces spécimens des spécimens qui étaient négatifs par examen histopathologique, l’échantillon était positif par DRB-PCR

Vue de la table grandDisque de téléchargementRésultats de la PCR DRB-PCR à base de réactif sec par rapport à l’examen histopathologiqueTable View largeDownload slideRésultats de la PCR DRB-PCR à base de réactif sec par rapport à l’examen histopathologique

Discussion

Le taux global de positivité de DRB-PCR des échantillons sur écouvillon était significativement inférieur au taux de positivité global de la PCR standard des échantillons sur écouvillon% Les taux globaux de positivité pour les échantillons de tissus% par DRB-PCR et% par PCR standard étaient comparables. DRB-PCR a montré des ratios de positivité globaux% significativement plus élevés pour les échantillons sur écouvillon et tissus que% examen microscopique pour les échantillons sur écouvillon et% pour les échantillons de tissus et de culture% pour les écouvillons et% pour les échantillons de tissus En général, comparé à l’étude pilote, le rapport de positivité global de DRB-PCR des écouvillons et des échantillons tissulaires a augmenté de% Cette augmentation peut être principalement attribuée aux critères d’inclusion des patients dans cette étude durée des lésions de & lt; comparé à tous les stades de la maladie chez les patients de l’étude pilote et à la collecte standardisée des échantillons. Le faible taux global de positivité des cultures était probablement dû à un traitement antimycobactérien à court terme préchirurgical, pratique courante au Ghana pendant la période d’étude. En raison du temps de génération prolongé des ulcères de M, la culture, en général, ne peut pas être considérée comme un outil pour le diagnostic opportun de BUD. Le taux de positivité de chaque méthode de test a montré une variation considérable quand analysé par hôpital. d’un test dépend de la qualité de l’échantillon de diagnostic soumis à l’analyse En règle générale, la collecte d’échantillons de frottis diagnostiques entourant l’ensemble du bord de la lésion est moins sujette aux erreurs que la collecte d’échantillons de tissus diagnostiques. à partir du bord des lésions au-dessous de l’extrémité du bord miné contenant des coupes de tissus nécrotiques et le sous-cutané s tissu adipeux, où les bacilles sont présents Dans les échantillons prélevés sur des tissus excisés, l’emplacement correct est difficile à définir, car l’extrémité du bord miné peut ne pas être clairement reconnaissable après l’excision. Les échantillons d’écouvillonnage provenant des hôpitaux étaient comparables à A% et D%. Cependant, le taux de positivité des échantillons de tissu ulcéreux correspondants de l’hôpital D% était considérablement inférieur à celui de l’hôpital A%. Ces résultats suggèrent que la collecte des écouvillons ne posait aucune difficulté. de ces hôpitaux; Cependant, la qualité du diagnostic clinique et, par conséquent, la sélection des patients pour le diagnostic en laboratoire, influencent fortement le taux de positivité d’un test de nodules d’onchocercose, par exemple, Le tableau BUD montre que seulement% des spécimens de l’hôpital D, situés dans une région où l’onchocercose est endémique, ont été confirmés par PCR. L’analyse histopathologique des échantillons prulceratifs ayant des résultats de PCR négatifs a révélé que% des Les lésions prulceratives de l’hôpital D étaient en fait des nodules de l’onchocercose L’onchocercose n’apparaissait pas dans les prélèvements prulceratifs de l’hôpital A, qui ne se trouvait pas dans une zone d’endémicité, et% de ces spécimens étaient confirmés par PCR. de BUD La majorité des lésions de patients avec des résultats histopathologiques positifs et négatifs Les résultats de la PCR ont progressé vers le stade de guérison, contenant peu ou pas de bacilles. Cette conclusion reflète la limitation majeure des PCR diagnostiques menant à des résultats faussement négatifs, comparée à l’examen histopathologique. La PCR est un outil diagnostique approprié seulement pour les stades précoces de la maladie. Des résultats d’examens histopathologiques faussement négatifs ont également été observés. Un patient présentant un tableau clinique typique de l’IUN, des résultats positifs d’examen microscopique d’écouvillons et des résultats positifs de PCR sur des écouvillons et des échantillons de tissus n’a pas été considéré comme ont un BUD par examen histopathologique Ainsi, un véritable gold standard pour la confirmation en laboratoire de BUD n’existe pas La spécificité de la PCR IS pour les mycobactéries cliniquement pertinentes a été étudiée ailleurs La seule espèce mycobactérienne détectable avec IS PCR, Mycobacterium liflandii, est présente uniquement dans des échantillons environnementaux Par conséquent, la PCR faussement positive réagit Les résultats de cette étude montrent que DRB-PCR est un outil fiable pour la confirmation en laboratoire des cas cliniquement diagnostiqués comme BUD par l’analyse d’écouvillons et de prélèvements tissulaires. Cependant, la performance du test est clairement liée à la qualité Pour obtenir des résultats fiables, le laboratoire ne doit pas limiter ses activités au travail de laboratoire mais doit collaborer étroitement avec les centres de traitement en ce qui concerne la formation et la supervision de la collecte des échantillons.

Remerciements

Nous remercions Anja Schörle, Petra Meyer et Birgit Raschdorff Institut Bernhard Nocht de médecine tropicale, Hambourg, Allemagne; Erna Fleischmann Département des maladies infectieuses et de médecine tropicale, Université Ludwig-Maximilians de Munich, Munich, Allemagne; et Leticia Kunaa Kumasi Centre de recherche collaborative, Kumasi, Ghana, pour une excellente assistance techniqueAssistance financière Subvention de la Fondation Volkswagen Projet I / I et Commission européenne INCO-CT — BURULIC Conflits d’intérêts potentiels Tous les auteurs: pas de conflits