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La persistance de la pneumolysine dans le liquide céphalorachidien des patients atteints de méningite à pneumocoque est associée à la mortalité

Dans les échantillons de patients, nous avons montré que les taux de pneumolysine dans le LCR restaient élevés après 48 heures chez les non-survivants de la méningite par rapport aux survivants. Le traitement antipneumolysique sélectif peut présenter une nouvelle option thérapeutique.

Streptococcus pneumoniae représente 50% de la méningite bactérienne chez les patients dans le monde, avec un taux de mortalité de 20% en Europe et de 50% à 60% en Afrique subsaharienne, avec jusqu’à la moitié des survivants avec des séquelles neurologiques graves [1, 2] Streptococcus pneumoniae exprime une gamme de facteurs de virulence des protéines associés à la colonisation des surfaces muqueuses et à l’invasion tissulaire subséquente [3] Les facteurs de virulence comprennent la pneumolysine Ply et la neuraminidase NanA; Ply est directement associée à des dommages neuronaux [4] Les dommages au tissu hôte sont médiés soit directement par des protéines bactériennes ou indirectement via la réponse inflammatoire de l’hôte [5] Les concentrations de pneumolysine dans le liquide céphalorachidien CSF dans un modèle animal atteignent 20 ng / mL-1. concentration similaire aux concentrations retrouvées dans le LCR des patients atteints de méningite à pneumocoques, qui étaient de 1-180 ng / mL [4] Un traitement antibiotique précoce améliore les résultats cliniques de la méningite [6, 7] La ​​dexaméthasone administrée comme adjuvant est bénéfique chez les adultes atteints de pneumocoque aigu. la méningite dans les contextes de soins développés [8] mais pas dans les pays à revenu intermédiaire et faible [1] Nous avons testé l’hypothèse selon laquelle les protéines persistantes du pneumocoque dans le LCR pourraient être associées à de mauvais résultats, malgré un traitement antibiotique

Méthodes

Population de l’échantillon

Nous avons précédemment recruté 465 patients atteints de méningite bactérienne dans un essai randomisé, contrôlé par placebo, à double insu, d’un traitement adjuvant à l’antibiotique dexaméthasone [2] Les critères d’inclusion dans cette étude étaient une suspicion clinique de méningite bactérienne et de liquide céphalorachidien positif sur microscopie sur la coloration de Gram ou> 100 globules blancs / mm2, dont> 50% étaient des neutrophiles. La protéine et le glucose du CSF ont été semi-quantitatifs en utilisant des bandelettes urinaires [9] Les patients recevaient 2 g de ceftriaxone par voie intraveineuse ou intramusculaire pendant 10 jours. Dexaméthasone ou placebo au moment de l’administration d’antibiotiques Des échantillons de LCR ont été prélevés avant l’administration des antibiotiques le jour de l’admission et un deuxième échantillon de LCR a été prélevé après 48 heures d’antibiothérapie chez un petit sous-groupe de patients. ou pour la surveillance du niveau de médicament Des échantillons appariés de LCR ont été conservés à -80 ° C Cette étude a été approuvée par le Comité d’éthique de la recherche de l’École de médecine tropicale de Liverpool et le Comité d’éthique de la recherche du Collège de médecine de l’Université du Malawi

Quantification de Ply et NanA

Les échantillons ont été séparés par électrophorèse sur gel de dodécylsulfate de sodium-polyacrylamide dans une dilution de 1: 5 en utilisant une solution saline tamponnée au phosphate et transférés sur des membranes de nitrocellulose. Pour la quantification, des dilutions en série du dérivé de l’anatoxine Pdb pneumolysine purifiée et de NanA ont été incluses sur tous les immunoblots. La concentration initiale de Pdb était de 12 mg / mL et NanA était de 014. mg / ml; les courbes standard ont été construites en utilisant densitométrie bande pour chaque dilution en série et comparée avec densité de bande dans les échantillons CSF Quantité Un logiciel Densitométrie des films a été réalisé avec Bio-Rad GS-700 imagerie densitomètre Bio-Rad Ply a été détecté comme une bande à 53 kDa et NanA à 108 kDa, respectivement Les résultats de densitométrie ont été analysés et les concentrations de niveaux d’antigène ont été calculées en microgrammes par millilitre pour NanA et milligrammes par millilitre pour Ply par échantillon CSF

Quantification de la charge bactérienne

Pour extraire l’ADN pneumococcique, 100 μL de CSF ont été prélevés et soumis à un protocole de digestion au lysozyme-tampon 20 mmol / L TrisCl pH 80, 2 mmol / L EDTA, 12% Triton-X-100, 100 μL de lysozyme 10 ×, et 10 μL de lysostaphine 10 ×, incubés pendant 1 heure à 56 ° C ADN Qiagen, Allemagne Des standards pneumococciques pour la réaction en chaîne par polymérase en temps réel PCR ont été créés en utilisant un nombre connu de copies du gène de l’autolysine synthétique LytA Eurofins, Allemagne L’ADN standard a été dilué logarithmiquement pour créer des étalons en série de 1 × 109 à 1 × 101 L’ADN standard et expérimental a été amplifié en utilisant le protocole ABI7300 Applied Biosystems, et les charges bactériennes exprimées en millilitres ont été extrapolées à partir du cycle valeurs seuils, calculées en utilisant le logiciel ABI L’analyse statistique a été réalisée en utilisant le test U de Mann-Whitney Les données sont exprimées en médiane avec intervalle interquartile IQR

RÉSULTATS

Cent quatorze participants à notre étude clinique avaient une méningite à pneumocoques confirmée par la culture. Parmi ceux-ci, 43 avaient tous les deux t = 0 et t = 48 échantillons disponibles. Tableau 1 Huit patients témoins avec céphalée sans méningite les patients de l’étude ont survécu au jour 10, et 15 sont morts le taux de mortalité 348%; Aucun patient n’est décédé dans le groupe témoin Tous les patients présentaient des taux thérapeutiques de ceftriaxone dans le liquide céphalo-rachidien, et tous les isolats étaient des concentrations inhibitrices minimales moyennes entièrement sensibles, 0038 μg / mL; plage, 00003-019 μg / mLPly et NanA concentrations ont été mesurées dans tous les échantillons Ply et NanA ont été détectés uniquement dans les échantillons de patients Ply médian, 1115 mg / mL [IQR, 005-027]; NanA médiane, 057 μg / mL [IQR, 006-104]; échantillons témoins: plis, 0 ± 0 mg / mL et NanA, 00 ± 0 μg / mL Figure 1A et 1B

Figure 1View largeTélécharger les diapositives A et B, Concentrations de pneumocoques protéines pneumolysine Ply et neuraminidase A NanA dans le liquide céphalorachidien CSF des patients atteints de méningite prouvée par rapport aux contrôles La limite inférieure de détection était de 2 ng / mL pour Ply et 10 ng / mL pour NanA C et D, Concentrations de protéines pneumococciques Ply et NanA dans le liquide céphalorachidien des méningites prouvées comparant les échantillons prélevés sur les survivants et les non survivants à l’admission et 48 heures La limite inférieure de détection était de 2 ng / mL pour Ply et 10 ng / mL pour NanA E , Charge bactérienne de Streptococcus pneumoniae dans le LCR des méningites prouvées comparant les survivants et les non-survivants à l’admission et 48 heuresFigure 1View largeTélécharger les diapositives A et B, Concentrations de pneumocoques protéines pneumolysine Ply et neuraminidase A NanA dans le liquide céphalorachidien CSF des patients atteints de méningite avec contrôles La limite inférieure de détection était de 2 ng / mL pour Ply et de 10 ng / mL pour NanA C et D, Concentratio ns des protéines pneumococciques Ply et NanA dans le LCR des méningites prouvées comparant les échantillons prélevés sur les survivants et non survivants à l’admission et 48 heures La limite inférieure de détection était de 2 ng / mL pour Ply et 10 ng / mL pour NanA E, charge bactérienne de Streptococcus pneumoniae dans le liquide céphalo-rachidien de patients atteints de méningite prouvée comparant les survivants et les non-survivants à l’admission et 48 heures

Tableau 1 Données démographiques et cliniques des participants à l’étude Caractéristiques Total Survivants DEX Survivants Placebo Non-survivants DEX Non-survivants Placebo Nombre de patients 43 20 465% 8 186% 8 186% 7 163% séropositifs 34 79% 15 7 5 7 Âge médian 29 IQR, 23 -36 275 34 31 28 Féminin 24 558% 12 4 3 5 Score médian de coma de Glasgow à la présentation 10/15 IQR, 8-14 13/15 105/15 85/15 11/15 CSF WCC, cellules / mm2 640 IQR, 110 -2720 920 7245 560 365 Protéine du LCR, trace = 30 g / L, 1 = 100 g / L, 2 = 500 g / L 2 2 2 2 2 LCR glucose, Neg = <28 mmol / L, trace / 1 = 28 mmol / L, 2 = 55 mmol / L Neg Neg Trace × 2 Trace × 1 Sérotype de Streptococcus pneumoniae, si connu Nombre de patients avec ce sérotype 4 1 1 1 1 1 1 1 1 2 3 1 7 1 7 1 1 14 33 1 1 2 15 1 Caractéristiques Total Survivants DEX Survivants Placebo Non-survivants DEX Non-survivants Placebo Nombre de patients 43 20 465% 8 186% 8 186% 7 163% VIH-p ositive 34 79% 15 7 5 7 Âge médian 29 IQR, 23-36 275 34 31 28 Féminin 24 558% 12 4 3 5 Score médian de coma de Glasgow à la présentation 10/15 IQR, 8-14 13/15 105/15 85 / 15 11/15 CSF WCC, cellules / mm2 640 IQR, 110-2720 920 7245 560 365 Protéine du LCR, trace = 30 g / L, 1 = 100 g / L, 2 = 500 g / L 2 2 2 2 2 LCR glucose , Neg = & lt; 28 mmol / L, trace / 1 = 28 mmol / L, 2 = 55 mmol / L Neg Neg Trace × 2 Trace × 1 Sérotype de Streptococcus pneumoniae où connu Nombre de patients avec ce sérotype 4 1 1 1 1 1 6 1 9 2 3 1 7 1 7 1 1 14 33 1 1 2 15 1 Abréviations: LCR, liquide céphalo-rachidien; DEX, dexaméthasone; VIH, virus de l'immunodéficience humaine; IQR, intervalle interquartile; WCC, nombre de globules blancsView Large

CSF Ply

Les survivants avaient des concentrations médianes de Ply à t = 0 de 003 mg / mL IQR, 001-012 et t = 48 heures de 001 mg / mL IQR, 00-005 P = 041 Figure 1C non invisives aux mêmes moments où les concentrations médianes de Ply 0075 mg / mL IQR, 001-013 et 007 mg / mL IQR, 001-010 à P = 98 Figure 1C La différence entre les niveaux de Ply à t = 48 entre les survivants et les non survivants était significative à P = 006

CSF NanA

Les échantillons de CSF de survivants à t = 0 et t = 48 après traitement antibiotique ne présentaient pas de différence significative dans leurs concentrations médianes de NanA de 04 μg / mL IQR, 00-07 et 02 μg / mL IQR, 00-05, respectivement, à P = 39 Figure 1D Les valeurs non invisibles aux mêmes moments étaient respectivement de 03 μg / mL, IQR, 0125-06 et 03 μg / mL IQR, 01-05, à P = 56 Figure 1D

Charge bactérienne du LCR par PCR

Tous les échantillons de LCR étaient stériles par culture à 48 heures. La charge bactérienne médiane du LCR mesurée par le nombre de copies PCR était significativement réduite à t = 48 par rapport à t = 0 chez les survivants; t = 0 nombre de copies était de 39 × 105 copies / mL IQR, 53 × 104 à 115 × 106 et t = 48 nombre de copies était 34 × 104 IQR, 156 × 104 à 89 × 104 copies / mL à P & lt; 005 Figure 1EIn non survivants le nombre de copies bactériennes CSF médian à t = 0 était 36 ​​× 105 IQR, 84 × 104 à 37 × 106 et à t = 48 heures, il était 13 × 105 IQR, 14 × 10 à 54 × 105 à P = 19 Figure 1E Les différences de charge bactérienne entre les survivants et les non-survivants à l’admission P = 89 et 48 heures après l’admission P = 07 étaient toutes deux non significatives

DISCUSSION

Dans cette étude, les taux de Ply étaient significativement réduits entre l’admission et 48 heures chez les survivants mais non chez les non survivants. Les non survivants avaient des niveaux plus élevés de CSF Ply à t = 0 Les niveaux de NanA ne changeaient pas significativement entre les 2 groupes. La charge bactérienne mesurée par le nombre de copies a diminué chez les survivants et les non survivants, avec une chute significative seulement dans le groupe des survivants. Dans le groupe non survivant, des niveaux élevés de Ply ont persisté et ont été associés à une chute non significative. La stérilisation du LCR dans les deux groupes suggère que la ceftriaxone a provoqué la mort bactérienne dans les deux groupes comme prévu. Cette étude n’explique pas le nombre de bactéries présentes dans le groupe de survivants. persistance de Ply dans le groupe non survivant mais suggère une association avec la mortalité Les valeurs absolues de Ply ne p L’absence de différences statistiquement significatives entre la charge bactérienne d’admission chez les survivants et les non survivants est en contraste avec un ensemble de données plus large de 82 échantillons de LCR du Malawi chez les enfants [10] et est probablement due aux plus petits nombres dans cette étude. Les niveaux de Ply dans les modèles animaux de méningite à pneumocoques étaient de 20 ng / mL-1 de CSF [4] Les niveaux de Ply étaient également significativement plus élevés que ceux de NanA dans la même étude. Patients Cela peut être dû à la libération de Ply sur la lyse bactérienne. Ply est nécessaire pour l’invasion microvasculaire des pneumocoques à travers la barrière hémato-encéphalique et est un puissant stimulateur de la réponse inflammatoire du LCR dans la méningite pneumococcique [11] l’intérieur de la cage abdominale est devenue malade en moins de 26 heures, alors que les animaux infectés par des mutants isogéniques déficients en pneumolysine sont restés asymptomatiques ou ont survécu L’association de niveaux élevés de CSF Ply et de non-survie des patients est une découverte nouvelle et souligne le rôle crucial de Ply dans la pathogenèse de la méningite dans les modèles animaux. a été montré pour avoir des rôles contradictoires dans l’inflammation; une étude a démontré que NanA médiée invasion pneumococcique des cellules endothéliales barrière hémato-encéphalique 14], et dans un autre déficit en NanA a été jugée sans influence sur l’évolution clinique de la maladie ni aucun effet sur la dissémination bactérienne systémique [13] En conclusion, nous avons constaté que tous les patients atteints de méningite à pneumocoques présentaient des niveaux plus élevés de Ply et de NanA que ceux attendus des modèles animaux extrapolés. La persistance de taux élevés de Ply chez les non-survivants malgré la diminution du nombre de bactéries suggère que cette protéine est impliquée dans la pathogenèse sévère Le blocage ou l’inhibition de la pneumolysine au cours d’une méningite aiguë pourrait représenter une option thérapeutique future pour améliorer la mortalité

Remarques

Aide financière

Ce travail a été soutenu par des subventions de la Meningitis Research Foundation à M S, le Dunhill Medical Trust à A K, et le Wellcome Trust Clinical PhD Fellowship à E C W et Career Development Fellowship, numéro de subvention 061231 à S B G

Conflits d’intérêts potentiels

Tous les auteurs: Aucun conflit rapporté Tous les auteurs ont soumis le formulaire ICMJE pour la divulgation des conflits d’intérêts potentiels Conflits que les éditeurs considèrent pertinents pour le contenu du manuscrit ont été divulgués