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Activité photodynamique des photosensibilisateurs liposomaux par transfert d’énergie de molécules d’antennes à [60] Fullerene

La thérapie photodynamique (PDT) est un traitement de nouvelle génération basé sur des espèces réactives de l’oxygène cytotoxiques (ROS) la production de réactions photochimiques entre les photosensibilisateurs photoexcités (PS) et l’oxygène moléculaire.1,2 En raison de la formation d’un état de triplet de longue durée de vie et de la capacité élevée de photoproduction des ROS, les fullerènes ont attiré l’attention comme PS de PDT.3 − Nous avons précédemment rapporté que la membrane lipidique liposomale peut être utilisée pour la solubilisation de fullerènes [60] non modifiés (C60) pour surmonter leur mauvaise solubilité dans l’eau. La membrane lipidique cationique produite incorporant C60 (LMIC60) a montré une cytotoxicité élevée sous irradiation lumineuse entre 350 et 10 nm. Cependant, d’un point de vue pratique pratique, la faible absorption de C60 entre 600 et 700 nm, qui est La plage de longueur d’onde optimale pour le PDT reste problématique. Dans la photosynthèse, l’énergie solaire est efficacement convertie en énergie potentielle chimique par des assemblages multiprotéines hautement organisés dans l’architecture de la membrane thylacoïdienne des chloroplastes. Dans ce processus, l’énergie des photons est absorbée par les molécules d’antenne pigmentaire et transférée aux centres de réaction. Le modèle de transfert d’énergie qui se produit entre les molécules d’antenne pigmentaire et les centres de réaction représente une approche attrayante pour surmonter la mauvaise absorption de C60 à de grandes longueurs d’onde. Dans cette étude, l’architecture de membrane thylacoïdienne mimétique PS liposomale de PDT ont été construites par la pêche à la lumière et l’extraction de la lumière # x0201c; antenne ” molécules et C60 dense en bicouches membranaires lipidiques (figure ​ (figure1) .1). Dans ce PS, la photoénergie a été absorbée par les molécules d’antenne et transférée à C60 pour générer le ROS. Pour construire le PS liposomal, LMIC60 est une plate-forme pratique pour placer les molécules d’antenne et C60 à proximité étroite parce que le liposome introduit par molécule d’antenne peut être facilement préparé par coloration des liposomes en utilisant une sonde à membrane lipidique. En employant des liposomes, un lien covalent direct entre les molécules d’antenne et C60 peut être évité, résultant en la génération efficace de ROS parce que les fullerènes non modifiés génèrent ROS plus efficacement que d’autres dérivés C60 chimiquement modifiés.14Figure 1 PS liposomale de LMIC60-DiD. On a préparé du PS liposomique de récolte de lumière sous la forme d’une membrane lipidique incorporant des molécules d’antenne C60 et DiD. L’énergie de la lumière absorbée par les molécules d’antenne et transférée à C60 pour générer des molécules ROS (singulet … 1,1 ′ -Dioctadécyl-3,3,3 ′, 3 ′ -tétraméthylindodicarbocyanine (DiD), dialkylée Les sondes à membrane lipidique carbocyanine ont été utilisées comme molécules d’antennes de capture de lumière car les sondes à membrane lipidique carbocyanine dialkylée n’ont pas de cytotoxicité appréciable, 15,16 et les molécules DiD ont un maximum d’absorption (λ max) de 648 nm dans les liposomes, ce qui correspond à la Les liposomes moissonnant la lumière de LMIC60-DiD ont été préparés par échange de fullerène à partir de la cavité de γ -cyclodextrine (γ -CDx) en liposomes contenant DiD (liposome-DiD) suivant une méthode précédemment rapportée .10 − 13 En raison de l’absorption intracellulaire efficace des liposomes par les cellules tumorales dans nos rapports précédents, des liposomes avec des surfaces cationiques ont été utilisés pour la préparation de LMIC60-DiD.10,11 Les structures de DiD et les lipides sont présentés sur la figure S1 dans le Supp informations d’orting. LMIC60-DiD, composé de DiD, de lipides et de C60, ont été produits dans un rapport molaire de 1: 40: 4. Les distributions de taille du LMIC60-DiD ont été mesurées par une méthode de diffusion dynamique de la lumière (DLS). Malheureusement, les distributions de taille de LMIC60-DiD n’ont pas pu être mesurées car l’absorption de DiD interfère avec le laser équipé dans l’instrument de mesure. Par conséquent, 1,1 ′ -dioctadecyl-3,3,3 ′, 3 ′ -tetramethylindocarbocyanine (DiI), qui est structurellement similaire à DiD, a été utilisé pour les mesures (figure S1 dans l’information de support). Le diamètre moyen du LMIC60-DiI était d’environ 90 nm et ne changeait pas lorsqu’il était irradié avec une lumière à une puissance de 17 mW cm2 et des longueurs d’onde supérieures à 510 nm (510 ∢ 740 nm) pendant 30 min. Pour confirmer que l’énergie de photons absorbée par les molécules d’antenne DiD est transférée à C60 dans LMIC60-DiD, l’extinction de fluorescence C60-dépendante de DiD a d’abord été analysée. Bien que les spectres d’absorption UV de DiD pour liposome-DiD et LMIC60-DiD (figure S2 dans l’information de support) étaient similaires, la fluorescence de DiD était réduite dans LMIC60-DiD par rapport à la fluorescence de DiD dans liposome-DiD (Figure S3 dans les informations de support). Ceci indique que l’énergie lumineuse absorbée par DiD peut être transférée à C60.L’activité photodynamique de LMIC60-DiD en utilisant des cellules HeLa humaines du cancer du col de l’utérus a ensuite été évaluée. Pour vérifier que l’activité photodynamique de LMIC60-DiD dépend des molécules d’antenne, DiI a été utilisé comme molécule d’antenne de référence. DiI a un λ max à 551 nm et absorbe à peine la lumière sur 600 nm (figures S1 et S2 dans les informations de support). Après incubation avec LMIC60-DiI et LMIC60-DiD, les cellules ont été exposées à la lumière avec des longueurs d’onde supérieures à 610 nm (610 − 740 nm), auxquelles la lumière est absorbée par DiD. En utilisant le test WST-8, la viabilité cellulaire a été mesurée dans des cellules irradiées et non irradiées légères en tant que rapport (%) comparé aux cellules non traitées. Les résultats ont montré qu’aucun échantillon n’avait une toxicité foncée, même aux concentrations les plus élevées utilisées (Figure 2a) .2a). De plus, seul LMIC60-DiD a réduit la viabilité des cellules HeLa en fonction de la photoréradiation. Tous les autres échantillons ne présentent aucune activité photodynamique. Cette activité photodynamique de LMIC60-DiD était dépendante de la dose du médicament, et la concentration inhibitrice moyenne (valeur IC50) a été estimée à environ. 2 μ M de DiD (Figure ​ (Figure2b) .2b). La valeur IC50 de LMIC60-DiD était approximativement égale à celle de Photofrin, le photosensibilisateur clinique le plus largement utilisé17,18 (la valeur IC50 de Photofrin dans les mêmes conditions est d’environ 2 μ M lorsque le nombre de moles est converti en des unités de porphyrine parce que la Photofrin comprend des oligomères de porphyrine contenant 2 unités, les Figures S1 et S4 dans les Informations de support). De plus, l’activité photodynamique dépendante de la molécule d’antenne a été contrôlée non seulement pour LMIC60-DiD mais également pour les cellules traitées avec LMIC60-DiI lorsque la longueur d’onde de photoirradiation était passée à plus de 510 nm (Figure S5 dans les Informations de Support). Ces données indiquent clairement que l’activité photodynamique du PS liposomique photogénique est liée à la longueur d’onde d’absorption des molécules d’antenne et que le transfert d’énergie des molécules d’antennes photoactivées à C60 peut se produire dans les liposomes.Figure 2Activité dynamique de LMIC60-DiD. (a) L’activité photodynamique a été déterminée en utilisant le test WST-8 à une concentration de fluorochrome de 5 μ Des liposomes natifs et LMIC60 ont été ajoutés aux mêmes concentrations lipidiques que LMIC60-DiD. (b) Dépendant de la dose … Pour identifier l’importance de placer les molécules d’antenne et C60 à proximité, les cellules HeLa ont été traitées simultanément avec LMIC60 et liposome-DiD. Bien que les cellules aient été traitées avec les mêmes concentrations de C60 dans LMIC60 et DiD dans le liposome-DiD comparé à celui de LMIC60-DiD ([C60] = 10 μ M, [DiD] = 2,5 μ M), l’activité photodynamique sur les cellules traitées simultanément a été significativement réduite (Figure ​ (Figure3) .3). Ces données indiquent que le voisinage des molécules d’antenne et C60 dans les liposomes est nécessaire pour induire l’activité photodynamique efficace de LMIC60-DiD.Figure 3 L’importance de placer les molécules d’antenne et C60 à proximité. L’activité photodynamique a été mesurée au LMIC60 et au liposome-DiD traitées simultanément aux cellules HeLa. Les cellules HeLa ont été traitées avec 10 & sgr; M de C60 et 2,5 μ M de DiD. Chaque ROS est bien connu pour être généré à partir de C60 excité par une réaction de transfert d’électrons de type I qui génère des anions superoxyde (O2) donnant des radicaux hydroxyle, et / ou une réaction de transfert d’énergie de type II qui génère des molécules d’oxygène singulet (1O2) .19 Pour identifier les espèces d’oxygène réactif généré à partir du LMIC60-DiD, l’effet du d-mannitol et de la l-histidine, les capteurs de radicaux hydroxyle et 1O2, respectivement, 20,21 ont été analysés. Comme le montre la figure 4, la l-histidine bloque efficacement la photocytotoxicité de LMIC60-DiD, alors que le d-mannitol est inefficace. Les résultats suggèrent que 1O2 généré par la réaction de transfert d’énergie de type II joue un rôle majeur dans l’activité photodynamique de LMIC60-DiD. En outre, les résultats suggèrent également que l’énergie des photons absorbée par les molécules DiD est transférée à C60 via le mécanisme de transfert d’énergie. Si l’anion radicalaire de C60 (C60 • −) a été généré par transfert d’électrons de DiD photoactivé à C60, seulement O2 • − aurait pu être produit par la réaction de type I entre C60 • − et l’oxygène (figure S6 dans l’information de support). Figure 4 Effet des capteurs de ROS sur l’activité photodynamique de LMIC60-DiD. L’activité photodynamique de LMIC60-DiD (5 μ M de DiD) a été mesurée en présence de 50 mM de l-histidine ou de 50 mM de d-mannitol. Chaque valeur représente la moyenne ± SD de trois expériences. … Pour confirmer davantage ces résultats, 1O2 et O2 • − la génération a été détectée par des méthodes chimiques en utilisant l’acide 9,10-anthracènedipropionique (APA) et le nitrobleu tétrazolium (NBT) comme détecteurs, respectivement.13,19 APA est converti en forme endoperoxyde par la réaction avec 1O2, ce qui à son tour conduit à une réduction de l’absorbance à 400 nm (figure S7a dans l’information de support). Génération de formazan par réduction de NBT en présence de O2 • − est détecté comme une augmentation de l’absorption à 560 nm (figure S7b dans l’information de support). La diminution de l’absorption de l’APA a été surveillée en fonction du temps après irradiation des échantillons. Comme le montre la figure 5a, 5a, le blanchiment photo-irradiant de l’APA en fonction du temps était sévère pour les échantillons LMIC60-DiD par rapport aux échantillons LMIC60. D’autre part, la réduction du NBT par O2 ∢ &#x02212 ;, n’a pas pu être détectée dans les échantillons de LMIC60-DiD photoréradiés, bien que le formazan ait été facilement détecté dans le contrôle positif complexe C60 · γ -CDx échantillons en présence de NADH (Figure 55b) .22 Ces données indiquent clairement que l’énergie photonique absorbée par les molécules DiD est transférée à C60 via un mécanisme de transfert d’énergie et que 1O2 a été généré à partir de C60 (Figure S6 dans les Informations de support). Figure 5 Détection de la génération de ROS par des méthodes chimiques (a) La génération de 1O2 a été détectée par la méthode de blanchiment de l’APA Le blanchiment de l’APA a été surveillé comme une réduction de l’absorbance à 400 nm (b) O2 • La génération a été détectée par la méthode NBT … Dans cette étude, nous avons démontré que la PS liposomale moissonnant la lumière de LMIC60-DiD présentait une activité photodynamique lorsqu’elle était exposée à la lumière avec des longueurs d’onde supérieures à 610 nm (610 − C’est la première démonstration d’acti photodynamique la valeur de C60 sous irradiation correspond à la longueur d’onde optimale pour la PDT. Cette activité photodynamique dépend de l’énergie photonique absorbée par les molécules d’antenne, et l’excitation de C60 se produit via le transfert d’énergie des molécules d’antenne à C60 entraînant la génération de 1O2. Les PS liposomiques de LMIC60-DiD ont été simplement préparées par des molécules d’antenne d’ancrage et un C60 dense en liposomes. La dégradation des liposomes in vivo peut facilement se produire par métabolisme. Ce taux élevé de dégradation des liposomes entraîne la séparation des molécules d’antenne et de C60 les unes des autres. Par conséquent, cet événement conduit à l’inhibition du transfert de photoénergie et ce système PS liposomique de récolte de lumière peut aider à soulager la dermatite photosensible, un effet secondaire connu de PDT.23 & 25 Bien que d’autres améliorations de la PS liposomale soient nécessaires pour améliorer l’activité photodynamique (en fait, le rapport molaire de C60 et DiD dans les liposomes peut être réduit, figures S8 et S9 dans l’information de support), ces résultats impliquent que le concept de liposome PS de capture de lumière de LMIC60 montre des promesses importantes dans le domaine. de la chimie médicinale. Des applications de PS liposomales à la lumière sont actuellement à l’étude dans nos laboratoires.