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Marqueurs immunologiques alternatifs pour documenter les multiples revaccinations réussies de la variole

Contexte La vaccination clinique contre la variole est traditionnellement définie par la réponse clinique. Cependant, seulement% des sujets de la campagne de revaccination contre la variole en Israël ont développé des signes cliniques plus précis. Quarante sujets ayant participé à la campagne de revaccination antivariolique et développé une prise clinique ont été appariés individuellement pour l’âge, le sexe et la variole avec des sujets n’ayant pas développé de prise clinique. Les marqueurs d’immunité contre la examinés plus tôt et jours et années après revaccinationResults Des niveaux plus élevés d’immunoglobulines totales IgG, IgG, et anticorps neutralisants ont été observés dans le groupe sans prélèvement avant la vaccination vs ELISAU avec une dilution du sérum inhibant l’effet cytopathique d’au moins% [PRNT] / mL [P & lt; ], vs ELISAU / mL [P & lt; ], et% vs% [P & lt; Le nombre moyen d’IgG totales, de sous-classes d’IgG, d’indice d’avidité et de PRNT était plus élevé chez les volontaires «take» que chez les non-take days Le groupe sans prélèvement n’était pas inférieur au groupe recevant tous les niveaux de marqueurs immunitaires de la vaccine mesurés des mois après la vaccination. De plus, la sécrétion moyenne d’interféron y et le pourcentage d’échantillons sériques avec des taux de PRNT ≥ étaient significativement plus élevés dans le groupe sans prélèvement. que dans le groupe prenant vs pg / mL [P & lt; ] et% vs% [P & lt; ] La plupart des sujets du groupe sans prélèvement ont été revaccinés avec succès contre la variole. Dans les circonstances de la vaccination de masse contre la variole émergente, il n’est pas nécessaire d’évaluer le succès de la revaccination chez les personnes ayant déjà reçu plusieurs vaccins antivarioliques.

La variole a été déclarée éradiquée après une campagne de vaccination réussie utilisant le vaccin vivant atténué . La menace d’une dissémination intentionnelle de la variole émergeant de la montée de la terreur mondiale a conduit divers pays à réévaluer leur statut immunitaire contre la variole et à élaborer des plans stratégiques de masse. vaccination; Certains ont même vacciné un groupe de premiers répondants potentiels Le vaccin antivariolique traditionnel a été produit à partir d’exsudats obtenus après infection de la peau animale ou de la membrane chorio-aloïdienne d’embryons de poulet par le virus de la vaccine. lancettes rotatives ou injecteurs Le critère classique pour une vaccination réussie contre la variole était la «prise clinique» définie comme l’apparition d’une vésicule ou d’une pustule sur le site de la vaccination – jours après l’immunisation. Les aiguilles chirurgicales et bifurquées sont probablement d’efficacité égale. Les études épidémiologiques sur les épidémies de variole ont suggéré que la vaccination antivariolique fournissait des décennies ou même une protection contre la maladie létale à ses receveurs . En conséquence, plusieurs études ont montré la présence d’un large éventail de marqueurs immunitaires humoraux et cellulaires à la vaccine. qui persistent pendant des décennies après sm vaccination contre la variole Parmi ces marqueurs, il y avait des immunoglobulines IgG spécifiques de la vaccine , des anticorps neutralisants , des lymphocytes B mémoire et des lymphocytes T mémoires Sauf dans les études sur les anticorps neutralisant la vaccine Les marqueurs immunitaires n’ont jamais été corrélés avec l’immunité protectrice contre la variole. Dans la campagne de revaccination antivariolique en Israël, seulement% des sujets ont développé une prise clinique. Ces résultats sont compatibles avec les pourcentages de prise clinique après revaccination signalés précédemment. Pour tester cette hypothèse, nous avons comparé le niveau de divers marqueurs immunitaires spécifiques de la vaccine chez des sujets ayant développé ou non une prise clinique après revaccination.

Méthodes

Conception de l’étude et population

Nous avons mené une étude prospective historique dans une cohorte d’adultes Israéliens en bonne santé âgés de – ans qui ont participé à une campagne de vaccination contre la variole des premiers répondants dans les Forces de Défense Israéliennes durant l’hiver – Tous les sujets ont été inoculés avec le virus de la vaccine. en utilisant la technique de la ponction multiple Nous avons comparé la présence et la quantité de différents marqueurs de l’immunité à la variole entre des sujets qui n’ont pas eu de prise clinique et des sujets qui ont subi un examen clinique. des vaccinations antirétrovirales antérieures et un suivi détaillé et bien documenté des réactions cliniques et immunologiques des participants étaient disponibles. L’innocuité, l’immunogénicité et la réactogénicité du vaccin dans ce groupe ont été récemment signalées Des sujets ayant participé à la défense israélienne Étude de campagne de revaccination des forces, les sujets ont convenu d’étendre la période de suivi Après l’appariement pour l’âge ± années, sexe et nombre de vaccinations antérieures contre la variole ± vaccination, les sujets de chaque groupe ont été inclus dans l’analyse finale

Procédures de laboratoire

Production et administration de vaccins

Le vaccin antivariolique utilisé a été fabriqué par les Laboratoires centraux du Ministère de la Santé israélien. Le vaccin a été produit par inoculation d’œufs de poule embryonnés avec la souche Lister du virus de la vaccine Après une période d’incubation, le virus a été prélevé sur les membranes chorioalantoïdes des embryons de poulet. Les flacons de vaccin contenaient une suspension de ~ unités formant pustules par millilitre UFP / mL de virus de la vaccine. Les sujets ont été inoculés par l’application de μL de la suspension de vaccin PFU / mL sur la peau recouvrant le muscle deltoïde. utilisé pour introduire le vaccin par voie intradermique via des ponctions rapides au sein d’une grappe de – mm Le site de vaccination a ensuite été recouvert d’un pansement adhésif semi-perméable

Définition de la prise clinique

Les réactions cliniques chez les vaccinés ont été activement surveillées au cours de l’étude en utilisant des questionnaires cliniques et des interviews sur des jours, des jours, des jours, des jours et des jours après la vaccination. la présence de vésicule, pustule, ulcère ou gale – jours après vaccination Le diamètre de la lésion ne faisait pas partie des critères d’évaluation de la prise clinique. Cependant, les sujets avec prise positive présentaient un diamètre de lésion de – mm, comparé à groupe de non-prise

Séparation des cellules et du sérum

Des échantillons de sérum mL et des échantillons sanguins mL ont été obtenus en utilisant des tubes EDTA BD Les cellules mononucléaires sanguines périphériques ont été séparées du sang frais en utilisant des tubes de préparation de cellules Vacutainer BD puis ont été remises en suspension dans du RPMI solution R plus sérum foetal de veau supplémenté en pénicilline, streptomycine et L-glutamine Des cellules fraîches ont été utilisées dans tous les essais. Le sérum a été séparé à l’aide de tubes de séparation du sérum.

Mesure des sous-classes d’IgG totales et d’IgG sériques de la vaccine

En d’autres termes, des plaques de microtitrage ont été enduites de μg / mL d’antigène de virus de la vaccine brut inactivé par la β-propiolactone IHD-J, μL / puits Omrix LabNes-ziona, Israël tamponné avec du tampon NaHCO mmol / L; pH, puis bloqué avec un tampon TSTA mmol / L Tris [pH,]; mmol / L de chlorure de sodium; % de l’azide de sodium; % Tween; et% de sérumalbumine bovine Des dilutions en série du sérum testé ont été incubées dans les plaques pour h à ° C. Des plaques ont été développées avec de l’IgG anti-humaine de lapin conjuguée à la phosphatase alcaline suivie de p-nitrophénylphosphate comme substrat. à nm a été mesurée et calculée pour être exprimée comme ELISAU / mLFor mesure des niveaux des sous-classes IgG de la vaccine -, un conjugué spécifique a été utilisé pour chaque sous-classe KPL échantillons de sérum ont été testés à / et / dilutions Résultats pour les sous-classes IgG – ont été calculés et exprimés comme ELISAU / mL

Test d’Avidité des Anticorps IgG Total

L’avidité des anticorps a été mesurée par ELISA d’élution avec le thiocyanate chaotrope, comme décrit ailleurs , modifié pour le test ELISA IgG de la vaccine. En bref, les échantillons de sérum ont été dilués pour atteindre une densité optique de ~ et ont été incubés sur une plaque revêtue d’antigène. Les plaques ont été lavées et du thiocyanate d’ammonium dilué dans le tampon de sérum à diverses concentrations de à M a été ajouté aux puits. Après min à température ambiante, les plaques ont été lavées et IgG anti-humaine de lapin conjuguée à la phosphatase alcaline, Un indice d’avidité a été généré en traçant le logarithme du pourcentage de réduction par rapport à la concentration en thiocyanate et en calculant la quantité de thiocyanate requise pour réduire l’absorbance dans un sérum donné. par %

Test de sécrétion d’interféron IFN-γ sur cellules T

Nous avons utilisé la méthode décrite par Samandary et al , avec quelques modifications. En résumé, la densité des PBMC fraîches, × / mL a été remise en suspension dans le milieu AIM-V Invitrogen avec μL / mL de l’antigène vaccinal brut inactivé IHD-J, β -propiolactone-inactivé, PFU / mL; Laboratoire Omrix pendant des heures en chambre humidifiée% CO et ° C Forma Scientific Phytohémaglutinine A PHA et AIM-V seuls ont été utilisés comme témoins positifs et négatifs Le surnageant a été recueilli et évalué pour les concentrations d’IFN-γ en utilisant un kit commercial ELISA. d’IFNy sécrétée a été déterminée en soustrayant la valeur de contrôle négative du niveau moyen. La limite inférieure de détection était de pg / mL.

Dosage de cellules B de mémoire spécifique de vaccin

Cette méthode a été adoptée à partir de Crotty et al , avec des variations mineures. Bref, les PBMC ont été étalées dans des puits à cellules x / puits dans R- complétées avec un mélange de mitogènes polyclonaux: /, extrait mitogène pokeweed Sigma-Aldrich, μg / mL de CpG phospho-ODN-Sigma-Aldrich, /, de mmol / L de ß-mercaptoethanol, et /, de Staphylococcus aureus Cowan Sigma-Aldrich Dix puits ont été cultivés par individu, sans milieu mitogène seulement. en% -% CO En préparation de l’essai ELISPOT par immuno-absorption enzymatique, de nombreuses plaques de filtration MAHA N ont été revêtues pendant une nuit avec une souche d’antigène vaccinal brut inactivée IHD-J inactivée par la ß-propiolactone; PFU / mL; Laboratoire Omrix Pour détecter toutes les cellules sécrétant des IgG, une plaque séparée a été enduite de μg / mL d’Ig anti-humain de chèvre Caltag Laboratories Les plaques ont été lavées et bloquées avec du RPMI et du BSA Sigma-Aldrich pendant – heures à ° C avant utilisation. lavé soigneusement, étalé sur des plaques ELISPOT, et incubé pendant – heures à ° C IgG antihumaine de chèvre marquée à la peroxydase suivie par -amino-éthylcarbozole Sigma-Aldrich ont été ajoutés pour visualiser les taches, qui ont été comptées en utilisant un lecteur BioSys ELISPOT. exprimée en pourcentage de cellules B spécifiques du virus de la vaccine des cellules B mémoires totales

Essai d’anticorps neutralisant la vaccine

Nous avons utilisé la méthode précédemment décrite. En bref, des échantillons de dilutions de sérum ont été mélangés avec des μL de TCD% de culture tissulaire infectieuse du virus de la vaccine IHD-J souche Le virus vaccinal résiduel a été détecté sur des cellules Vero. la plus forte dilution de sérum qui a inhibé l’effet cytopathique d’au moins% PRNT

La validation des données

La reproductibilité des dosages a été documentée par le nouveau test du pourcentage d’échantillons. Pour tous les dosages, le coefficient de variance était inférieur à%. Les échantillons sanguins obtenus de sujets naïfs de la vaccine ont été utilisés pour confirmer la spécificité des marqueurs immunologiques. Le groupe inclus dans cette étude avait un âge ± écart type [SD] de ± ans, et% étaient des femmesAucune donnée de laboratoire antérieure n’a été utilisée pour l’analyse dans cette étude Les tests ont été conçus de sorte que les échantillons appariés ont été examinés dans la même procédure

Analyses statistiques

L’analyse statistique a été réalisée en utilisant le logiciel SPSS, la version SPSS Technologies l’appariement a été réalisée en utilisant le logiciel SAS, la version SAS Institute en utilisant un algorithme d’appariement décrit Les comparaisons de variables continues entre les groupes d’étude ont été réalisées variables non paramétriques Les différences entre les variables catégorielles ont été comparées à l’aide du test χ Les comparaisons de groupes multiples non paramétriques ont été effectuées à l’aide du test postérieur de Friedman et Dunn

RÉSULTATS

Exemple d’étude

Les caractéristiques de base des sujets étudiés sont résumées dans le tableau Les âges moyens ± écart-type des groupes prenant et non-prenant étaient ± et ± ans, respectivement Soixante-huit pour cent des sujets étaient des hommes Le nombre le plus fréquent de vaccinations précédentes était dans les deux groupes des personnes ayant participé à l’étude ont été examinées des mois après la revaccination. Le nombre moyen d’années ± écart-type passé de la dernière vaccination antivariolique avant la revaccination était plus élevé dans le groupe prenant que dans le groupe sans prélèvement ± années vs ± années, P & lt;

Niveaux sériques totaux des sous-classes d’IgG et d’IgG

Le tableau résume les concentrations sériques totales d’IgG dans les groupes à prise et sans prise Les taux d’IgG totaux étaient plus faibles dans le groupe sans prélèvement que dans le groupe prenant à la journée vs ELISAU / mL; P = En revanche, les taux d’IgG totaux au jour étaient plus élevés dans le groupe sans prise que dans le groupe prenant vs ELISAU / mL; P = Les niveaux d’IgG étaient similaires entre les groupes mois après la vaccination vs ELISAU / mL; P = Les niveaux d’IgG au jour étaient négativement corrélés avec le nombre d’années écoulées depuis la dernière vaccination, après ajustement pour le sexe, l’âge et le nombre de vaccinations antérieures r = -; P =

Tableau Caractéristiques de base des sujets étudiés Caractéristique Le groupe sans prélèvementa n = Le groupe à prise n = Population totaleb n = Âge, années moyennes ± SD ± ± ± Non% de sujets masculins Nombre médian de vaccinations antérieures – – – Intervalle depuis la vaccination antérieure , années moyennes ± SD ± ± ± Caractéristique Le groupe sans prélèvementa n = Le groupe à prise n = Population totaleb n = Âge, années moyennes ± SD ± ± ±%% de sujets masculins Nombre médian de vaccinations antérieures – – – Intervalle depuis vaccination antérieure, années moyennes ± écart-type ± ± ± écart-type SD, écart-typeaExaminé dans la présente étudebRevacciné contre la variole et ayant déjà fait l’objet d’une enquête View Large

Tableau Niveaux de marqueurs immunitaires de la vaccine dans les marqueurs « Prendre » versus « Pas de prise », temps Le groupe sans prise Le groupe de prise P Niveau total d’IgG, moyenneELISAU / mL% IC Jour – – Jour – – Mois – – Total IgGlevel, ELISAU moyen / mL% CI Jour – – Jour – – Mois – Niveau d’IgG, ELISAU moyen / mL% CI Jour – – Jour – – Mois – Niveau d’IgG, ELISAU moyen / mL% CI Jour – – Jour – – Mois – – Moyenne PRNTalevel% CI Jour – – Jour – – Mois – – No% de sujets avec un niveau PRNT ≥: Jour Jour Mois Indice d’avidité, M Jour – – Jour – – Mois – – Niveau IFN-γ, moyenne pg / mL% CI – – Pourcentage de cellules B spécifiques à la vaccination,% IC moyen – – NS Marqueur, temps Le groupe sans prélèvement Le groupe de prélèvement P Niveau d’IgG total, meanELISAU / mL% CI Day – Jour – – Mois – – IgGlevel total, ELISAU moyen / mL% CI Jour – – Jour – – Mois – Niveau d’IgG, ELISAU moyen / mL% CI Jour – – Jour – – Mois – Niveau d’IgG, ELISAU moyen / mL % CI Jour – – Jour – – Mois – – Moyenne PRNTalevel% CI Jour – – Jour – – Mois – – No% de sujets avec un niveau PRNT ≥: Jour Jour Mois Indice d’Avidité, M Jour – – Jour – – Mois – – Taux d’IFN-γ, moyenne pg / mL% IC – – pourcentage de lymphocytes B spécifiques à la vaccine,% d’IC ​​moyen – – NS NOTE CI, intervalle de confiance; Ig, immunoglobuline; IFN-interféron; NS, non significatif; PRNT, la plus forte dilution de sérum qui a inhibé l’effet cytopathique d’au moins% a Comparaison a été réalisée en utilisant Wilcoxon testView Les LargeLevels de sous-classe IgG étaient plus élevés dans le groupe sans prise que dans le groupe de prise par jour vs ELISAU / mL; P = Niveaux de toutes les sous-classes d’IgG – ont été trouvés plus faibles dans le groupe sans prise que dans le groupe de prise le jour vs ELISAU / mL [P =], vs ELISAU / mL [P =] et vs ELISAU / mL [P =], respectivement Les taux sériques des sous-classes d’IgG totales et d’IgG étaient indétectables chez les sujets naïfs

Test de neutralisation

Les niveaux moyens de PRNT dans le groupe sans prélèvement, comparé au groupe de prise, étaient plus élevés le jour vs; P = et plus bas le jour vs; P = Aucune différence significative n’a été trouvée entre les groupes des mois après la vaccination. Les taux de PRNT étaient tous <&> dans les sujets naïfs. Les unités de mesure sont PRNT pour le dosage de neutralisation.

Sécrétion d’IFN-γ

Les taux de sécrétion d’IFN-y après incubation avec l’antigène de la vaccine brut étaient plus élevés dans le groupe sans prélèvement que dans le groupe à prendre après la revaccination vs pg / mL; P =; les niveaux étaient indétectables chez les sujets naïfs Figure Manque de sécrétion d’IFN-γ a également été observée chez les sujets du groupe sans prélèvement

Figure Vue grandDownload slide Comparaison des niveaux IFN-γ de l’interféron Entre les groupes « take » et « no-take » Ligne fine, valeur moyenne; ; lignes épaisses,% intervalle de confiance * Niveau significativement plus élevé, comparé au groupe de prise P = Figure Voir grandDownload slide Comparaison des niveaux IFN-γ de l’interféron Entre les groupes « take » et « no-take » Ligne fine, valeur moyenne; ; lignes épaisses,% intervalle de confiance * Niveau significativement plus élevé, comparé au groupe de prise P =

IgG Anticorps Avidité

Dans l’ensemble, l’indice d’avidité était plus faible le jour que les jours et mois P & lt; et P =, respectivement, sans différence significative entre le jour et les mois suivant la revaccination P = Les niveaux de l’indice d’avidité étaient plus élevés dans le groupe prenant que dans le groupe sans prélèvement le jour vs M; P = mais étaient similaires à des mois vs M; P =

Pourcentage de lymphocytes B spécifiques au vaccin

Aucune différence n’a été trouvée entre les groupes dans le pourcentage de cellules B spécifiques de la vaccine mesurées dans des échantillons de sang obtenus des mois après la revaccination.

DISCUSSION

e après revaccination Notre hypothèse était que, quelques mois après la revaccination, les valeurs de ces marqueurs seraient similaires dans les groupes, ce qui impliquerait qu’un résultat de non-consommation immédiatement après la revaccination serait un résultat faussement négatif en reflétant la réponse immunitaire induite par la revaccination. , nous avons montré que les niveaux de marqueurs immunitaires humoraux et cellulaires spécifiques à la vaccine dans le groupe sans prélèvement étaient similaires et même plus élevés que dans les groupes IgG et les indices d’avidité après des mois de suivi étaient similaires dans les deux groupes, alors que IFN-γ Les taux de PRNT étaient significativement plus élevés dans le groupe sans prélèvement. Quatre-vingt-quinze pour cent des revaccinés sans prise clinique présentaient des taux d’anticorps anti-PRNT, et des niveaux détectables d’IFN-γ, et tous présentaient des niveaux significatifs marqueurs mois après revaccination La spécificité de ces marqueurs a été confirmée par leur absence complète parmi les sujets naïfs également examinés dans cette étude. Intéressant, dans une étude récente, nous a montré que les femmes en bonne santé antérieurement vaccinées ± âge, SD ± ans ont montré des niveaux détectables de IFN-γ et PRNT à un intervalle moyen ± ET de ± ans après la vaccination Comme prédit, les niveaux PRNT et IFN-γ chez les femmes étaient plus faibles que les deux groupes d’étude des mois après la vaccination.Dans une étude récente, Treanor et al ont évalué des anticorps neutralisants spécifiques de la vaccine et des cellules productrices d’IFN-y chez des sujets ayant subi une primovaccination par rapport à ceux ayant subi une revaccination dans un passé récent. années et passé lointain & gt; Ils ont également observé un taux de prise plus élevé dans le groupe des revaccinés lointains que parmi les revaccinés récents. Ils ont également constaté un taux de prise plus faible parmi les deux groupes de revaccinés, comparé aux primovaccinés% et% vs%. les cellules productrices spécifiques d’IFN-γ et les anticorps neutralisants ne sont pas fortement corrélés avec la prise clinique, suggérant que la réponse au site local d’inoculation et les paramètres mesurés dans le sang périphérique pourraient être considérés comme des marqueurs distincts de l’immunité. Pendant des décennies et même pour toute une vie, les données de la période d’éradication montrent que le niveau de protection contre la variole chez les personnes vaccinées dans le passé était compris entre% et% [,,,] Cette notion a été récemment confirmée par les marqueurs immunologiques à la variole chez les personnes qui avaient été vaccinées des années auparavant Cependant, ces marqueurs immunitaires de substitution n’étaient pas utilisés pendant l’éradication période; ainsi, aucune donnée n’est disponible sur leur relation directe avec l’immunité protectrice contre la variole. Plusieurs études ont mentionné un titre d’anticorps neutralisant comme marqueur immunologique potentiel pour l’immunité protectrice contre la variole. [Taub et al.] ont mené une étude longitudinale dans laquelle ils ont quantifié les taux d’IgG et d’anticorps neutralisants de la vaccine chez les sujets vaccinés ≥ années – années avant l’évaluation. En% des échantillons, ils ont trouvé que les niveaux de PRNT allaient de: à: et restaient tableaux Seuls les patients% n’avaient pas d’anticorps neutralisants mesurablesPour examiner l’effet Nous avons comparé les marqueurs immunitaires chez des sujets ayant subi des revaccinations multiples. Nous avons trouvé des marqueurs immunitaires légèrement plus élevés sauf pour le PRNT dans le groupe de revaccination multiple, mais aucune des différences n’était significative. Ces résultats sont compatibles avec ceux de l’étude de Taub et al Notre étude comporte plusieurs limites Le biais de sélection est possible, en Le biais de rappel concernant le nombre de vaccinations antérieures a été traité en produisant un algorithme qui extrapolait le nombre de vaccinations antirétrovirales antérieures sur la base des antécédents de vaccination antivariolique, de la date L’évaluation de la prise clinique a été effectuée conformément aux définitions du Ministère israélien de la Santé. Ces définitions sont légèrement différentes des définitions de l’Organisation mondiale de la Santé; Ce biais a été réfuté après une comparaison minutieuse entre les critères du ministère israélien de la Santé et de l’Organisation mondiale de la santé. En conclusion, nous avons montré que la prise clinique n’est pas assez sensible pour évaluer la vaccination antivariolique. PRNT et / ou IFN-γ, ont été détectés des années après la revaccination chez tous les sujets sans prise. Dans les circonstances de l’immunisation de masse variolique émergente, il n’est pas nécessaire d’évaluer le succès de la revaccination chez les personnes ayant déjà été vaccinées. a été soutenu par une bourse de recherche du Corps de la Défense israélienne et du Ministère israélien de la Défense Conflits d’intérêts potentiels: Tous les auteurs: aucun conflit